人骨髓胚胎樣干細(xì)胞分離、鑒定及其移植治療DMD模型-dko小鼠的實驗研究.pdf

1、研究背景：Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種由于dystrophin基因突變導(dǎo)致肌纖維變性壞死的致死性X-性連鎖隱性遺傳性肌病，目前尚無有效的治療方法。干細(xì)胞移植為DMD的治療帶來希望。DMD的干細(xì)胞治療是以不同的方式移植帶有正常dystrophin基因的干細(xì)胞給病人，通過干細(xì)胞在體內(nèi)肌肉組織中表達(dá)dystrophin蛋白而改善病人臨床癥狀的治療方法。已有研究表明，通過

2、移植人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)可以在移植受體內(nèi)分化為肌細(xì)胞并表達(dá)dystrophin蛋白，但是hMSC移植治療后成肌分化效率較低，還不能取得較好的治療效果。因此，分離擴(kuò)增成肌分化能力更強(qiáng)的干細(xì)胞作為種子細(xì)胞是提高DMD患者治療效果的重要途徑。運(yùn)用原本擴(kuò)增人胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)液來分離擴(kuò)增成體骨髓干細(xì)胞，是一個很有創(chuàng)意的嘗試。已有研究表明：運(yùn)用胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方法可以從人骨髓中分離到比較原始的胚胎樣干細(xì)胞(hELSC)，其表達(dá)胚胎干

3、細(xì)胞的部分抗原標(biāo)志，可以分化為表達(dá)三胚層抗原標(biāo)志的細(xì)胞。我們推測hELSC也可在一定條件下分化為肌細(xì)胞，并可能具有比MSC更強(qiáng)的成肌分化能力，如果移植治療DMD患者，可能會提高治療效果。在mdx小鼠基礎(chǔ)上通過雙基因敲出方法獲得的dko小鼠是DMD細(xì)胞治療的理想動物模型。本研究從人骨髓中分離、鑒定了hELSC，并觀察了其移植治療DMD模型-dko小鼠的可行性，研究結(jié)果為臨床治療DMD提供了新的種子細(xì)胞和實驗依據(jù)。
　　 目的：建立

4、hELSC的分離、鑒定方法，研究其生物學(xué)特性及體內(nèi)外成肌分化能力，為臨床治療DMD提供新的種子細(xì)胞和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 ⑴為了分離hELSC，參照Battula報道的無血清培養(yǎng)方法[含20％的血清替代物(SR)、2mM的谷氨酰胺(Gln)、1％的非必需氨基酸(NEAA)、0.1mM的2-巰基乙醇(2-ME)和一定濃度堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的Knockout-DMEM]在0.1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培

5、養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞。同時，運(yùn)用有血清培養(yǎng)方法(含10％新生牛血清的DMEM/F12)按照相同的細(xì)胞密度在未包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)相同來源的骨髓單個核細(xì)胞以分離hMSC。
　　 ⑵為了優(yōu)化hELSC的分離培養(yǎng)方法，運(yùn)用含有不同濃度的bFGF(5、10、15ng/ml)的無血清培養(yǎng)液的分離相同的骨髓單個核細(xì)胞，篩選bFGF的最佳濃度。
　　 ⑶運(yùn)用免疫染色方法分析有血清培養(yǎng)方法和改進(jìn)的無血清培養(yǎng)方法分離到的第一代hMSC和hELS

6、C表達(dá)的抗原標(biāo)志。比較hMSC和hELSC抗原標(biāo)志的表達(dá)率。
　　 ⑷運(yùn)用改進(jìn)后的無血清培養(yǎng)方法和有血清培養(yǎng)方法分離不同年齡供體來源的骨髓單個核細(xì)胞，觀察hELSC分離與供體年齡的關(guān)系。
　　 ⑸收集第四代hELSC和hMSC制成超薄切片，運(yùn)用透射電鏡觀察hELSC和hMSC的超微結(jié)構(gòu)。
　　 ⑹免疫染色方法檢測誘導(dǎo)不同時間(3、6、9、12、15天)的hELSC的成肌分化效率(成肌分化效率=MHC陽性肌纖維數(shù)/

7、細(xì)胞總數(shù))，分化效率最高的誘導(dǎo)時間即為最佳誘導(dǎo)時間。
　　 ⑺hELSC移植后3月剖析小鼠各器官，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)有無異?；蚰[瘤的發(fā)生。
　　 結(jié)果：①參照Battula等報道的無血清培養(yǎng)液(含20％SR、2mM Gln、1％NEAA、0.1mM2-ME和5ng/ml的bFGF的Knockout-DMEM)在0.1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞，可以從非血液系統(tǒng)疾病患者骨髓中分離到hELSC，但成功率很低(1/25

8、)。很顯然，作為促細(xì)胞增殖因子，bFGF是影響hELSC分離的重要因素，含5、10、15ng/ml bFGF的培養(yǎng)液分離到的第一代hELSC的SSEA-4陽性率依次分別為12.8％、56.8％和53.1％。初步說明增加bFGF的濃度可以有效誘導(dǎo)SSEA-4的表達(dá)，而加入10ng/ml的bFGF是比較適宜的濃度，因此，運(yùn)用含20％SR、2mM Gln、1％NEAA、0.1mM2-ME和10ng/ml bFGF的Knockout-DMEM懸

9、浮骨髓單個核細(xì)胞并在0.1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中分離hELSC是比較理想的方法。
　　 ②運(yùn)用改進(jìn)后的無血清培養(yǎng)液(含20％SR、2mM Gln、1％NE/AA、0.1mM2-ME和10ng/ml bFGF的Knockout-DMEM)在0.1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞，可以更容易分離到hELSC。同時，運(yùn)用含10％新生牛血清(NCS)的DMEM/F12培養(yǎng)液在未包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)來自相同骨髓的單個核細(xì)胞，可以分離到人

10、間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)。兩種培養(yǎng)體系中所用單核細(xì)胞相同、細(xì)胞密度也完全相同，但分離到的hELSC和hMSC卻在細(xì)胞形態(tài)等方面存在明顯不同。原代hELSC體積細(xì)小、形態(tài)均一，均勻分布。經(jīng)5次以上傳代后hELSC體積逐漸增大，呈長條狀。而原代hMSC體形較大，通常有長梭形、多角形或圓形等多種形態(tài)的細(xì)胞出現(xiàn)，傳代后細(xì)胞形態(tài)逐漸變得均一，呈扁平狀，細(xì)胞集落生長明顯，經(jīng)5次以上傳代后，形態(tài)更加扁平，出現(xiàn)明顯老化特征。
　　 ③免疫染色h

11、ELSC和hMSC兩種細(xì)胞均檢測不到TRA-1-81、TRA-1-60、LIN-28、c-Myc、GKLF以及CD34陽性表達(dá)，均可在hELSC和hMSC細(xì)胞膜檢測到SSEA-4的陽性表達(dá)，但hMSC明顯呈弱陽性，而只有在hELSC細(xì)胞核檢測到Oct-4、Nanog和Sox-2表達(dá)，但均呈弱陽性。
　　 ④hELSC的一個突出特點是絕大部分細(xì)胞膜表面有十分顯著的偽足，呈花朵狀形態(tài)，少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜僅形成少量微絨毛樣突起；細(xì)胞胞漿

12、內(nèi)空泡較少或沒有，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但不擴(kuò)張。與之不同的是部分hMSC細(xì)胞膜光滑無突起，部分細(xì)胞膜表面有微絨毛樣突起，多數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)有大小不一的空泡，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)而且明顯擴(kuò)張形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，池內(nèi)顯示中等程度的電子密度，提示粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)存在分泌物。表明第四代hMSC處于一定程度的分化狀態(tài)，而且細(xì)胞純度不高，而hELSC屬于相對比較原始的細(xì)胞。
　　 ⑤盡管hELSC顯示不成熟細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)并表達(dá)胚胎干細(xì)胞的部分抗原標(biāo)志

13、，但在移植治療小鼠的各器官均未發(fā)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)異常和腫瘤或畸形的發(fā)生(包括被毛顏色變化的2只小鼠)，初步說明hELSC移植治療小鼠也是安全的。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴運(yùn)用改進(jìn)的無血清培養(yǎng)基(即含20％血清替代物、2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、0.1mM2-巰基乙醇和10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子的Knockout-DMEM培養(yǎng)液)在0.1％明膠包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)骨髓單個核細(xì)胞，可以從20％的人骨髓樣品(5/25)中

14、分離到胚胎樣干細(xì)胞(hELSC)，供體年齡越輕，越容易分離成功。
　　 ⑵與運(yùn)用有血清培養(yǎng)基(即含10％新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液)分離到的間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)相比，來自相同骨髓的hELSC具有不成熟的細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)并表達(dá)胚胎干細(xì)胞的抗原標(biāo)志SSEA-4、Oct-4、Nanog和Sox-2，但不會形成畸胎瘤。hMSC也表達(dá)SSEA-4，但表達(dá)率顯著低于hELSC。
　　 ⑶運(yùn)用由10ml胎牛血清、2ml谷

15、氨酰胺、0.1ml重組人表皮生長因子、0.1ml地塞米松、0.1ml兩性霉素B和100ml骨骼肌生長培養(yǎng)液組成的成肌分化誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)10天，可將hELSC和hMSC誘導(dǎo)為表達(dá)MHC和Myogenin蛋白的多核肌纖維，RT-PCR正實表達(dá)了MHC和Myogenin基因。然而，hELSC的成肌分化效率顯著高于hMSC。
　　 ⑷靜脈移植hELSC治療dko小鼠，hELSC可遷移到腓腸肌存活至少3個月，并表達(dá)dystrop