寒濕及濕熱環(huán)境與類風濕關節(jié)炎相關自身抗體表達特征的實驗研究.pdf

1、本研究胡蔭奇主任醫(yī)師指導下，在大鼠佐劑性關節(jié)炎模型的基礎上，給與CCP多肽抗原免疫動物，使大鼠發(fā)生佐劑性關節(jié)炎的同時體內(nèi)產(chǎn)生抗環(huán)瓜氨酰多肽抗體，大鼠體內(nèi)產(chǎn)生CCP抗體的免疫反應過程可能類似于RA的發(fā)病過程，在此基礎上給予不同的環(huán)境因素刺激，并檢測AKA，APF，RA33，anti-CCP和RF表達水平，研究環(huán)境因素與自身抗體表達的關系以及自身抗體表達與實驗大鼠關節(jié)病理改變以及相關細胞因子表達的關系，為臨床及時早期確定那些有可能發(fā)展成頑固

2、的，嚴重的病例提供實驗依據(jù)，同時探討RA寒濕痹阻及濕熱閉阻病證結合動物模型的建立方法?！　嶒灧椒ǎ哼m齡雌性的健康SD大鼠32只，隨機分成4組，每組8只；依照隨機表法分為正常對照組(正常組)，佐劑+CCP抗原組(模型組)，佐劑+抗原+寒濕環(huán)境組(寒濕組)，佐劑+CCP抗原+濕熱環(huán)境組(濕熱組)，模型組：使用人工合成的CCP多肽抗原100～150μg與完全福氏佐劑0.1ml混合后對一組大鼠雙側足底部注射；隔2周，尾尖取血1ml制備血清備

3、用，4周后心臟穿刺抽血4～6ml，制備血清備用；濕熱組：除與模型組相同處理以外，在接受免疫后1～9天，每天在人工氣候箱內(nèi)接受濕熱刺激一次，每次持續(xù)1小時，相對濕度95％～100％，溫度30～33℃；寒濕組：除與模型組相同處理以外，在接受免疫后1～9天，每天在人工氣候箱內(nèi)接受寒濕刺激一次，每次持續(xù)1小時，相對濕度95％-100％，溫度7-10℃；正常組：不做任何處理，與以上各組同時心臟穿刺取4～6ml血，制備血清備用；實驗結束時，取雙側踝

4、關節(jié)，40％多聚甲醛固定備用。 結果：一般情況：第一周：寒濕組大鼠明顯畏寒，蜷臥少動，大便時軟時溏；濕熱組大鼠躁動汗出，呼吸心跳加快，飲水量增加；模型組大鼠活動量減少，飲食及其他情況正常；正常組大鼠活動，飲食及其他情況均正常。第二周～第四周，寒濕組大鼠明顯蜷臥少動，萎靡不振，行動遲緩，反應遲鈍，跖趾部體毛脫落，食量減少，大便時軟時溏；濕熱組大鼠由躁動逐漸變?yōu)榛顒恿繙p少，萎靡不振，反應遲鈍，倦怠汗出，體毛失去光澤，關節(jié)紅腫較甚，個別

5、大鼠出現(xiàn)跖底部潰瘍，飲水量較第一周減少，但仍比其余各組飲水量多，部分大鼠大便軟，偶有便溏，部分大鼠大便干燥；模型組大鼠體毛失去光澤，飲食量稍有減少，活動及大便等均正常。　　觀察前，6，12，18，24，30天各組體重檢測結果，正常組隨時間的推移體重逐漸增加，造模或造模加寒濕或濕熱環(huán)境從試驗第18天起可明顯影響體重的正常增長趨勢，其中濕熱環(huán)境對體重的影響最明顯，且隨時間的延長，影響程度逐漸加重，而模型組和寒濕組對大鼠體重的影響趨于平穩(wěn)，

6、無繼續(xù)增長趨勢?！　∮^察前，6，12，18，24，30天各組雙側后肢跖趾厚度檢測結果，造模從試驗第6天起對大鼠雙側后肢跖趾厚度具有非常顯著性影響，濕熱和寒濕環(huán)境更加重了對大鼠右后跖趾厚度的影響，且隨著時間的推移，這種影響逐漸加重，濕熱環(huán)境雖然有影響更為嚴重的趨勢，但濕熱和寒濕環(huán)境之間無顯著性差異?！　≡囼灨鹘M血清免疫球蛋白檢測結果，試驗2周末造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能明顯提高血清IgA，IgM，IgG等三種免疫球蛋白的水平，且濕

7、熱環(huán)境對IgA，IgM血清水平的提高作用更顯著，而寒濕環(huán)境則對IgG血清水平的提高有更顯著影響；試驗1月末造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能明顯提高大鼠血清IgA，IgM，IgG等三種免疫球蛋白的水平，但濕熱和寒濕環(huán)境對IgA，IgM，IgG血清水平的提高無明顯影響作用；造模加濕熱環(huán)境能使大鼠血清IgM水平在2周末達到高峰后，在1月末又顯著降低；造模加寒濕環(huán)境及單純造模均能使大鼠血清IgM水平2周末達到高峰后，在1月末雖有下降趨勢但均無顯著

8、性意義；2周末與1月末正常組IgM，試驗各組IgG和IgA血清水平的變化無顯著性差異?！　≡囼灨鹘M血清ASO檢測結果，試驗2周末，造模加濕熱環(huán)境能顯著升高大鼠血清ASO水平，但單純造模及造模加寒濕環(huán)境對大鼠血清ASO水平均無明顯升高作用；試驗1月末，造模加濕熱環(huán)境能顯著升高大鼠血清ASO水平，但單純造模及造模加寒濕環(huán)境對大鼠血清ASO水平均無明顯升高作用；造模加濕熱環(huán)境使大鼠血清ASO水平在2周末明顯升高并達到高峰后，在1月末又稍有下

9、降趨勢，但下降幅度無顯著性意義(P＞0.05)；造模及造模加寒濕環(huán)境在1月末也均可使大鼠血清ASO水平稍有下降趨勢，但下降幅度也均無顯著性意義(P均＞0.05)，正常組2周末與1月末2周末與1月末ASO血清水平的變化無顯著性差異。　　試驗各組血清RF檢測結果，試驗2周末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清RF水平，且造模加寒濕或濕熱環(huán)境對大鼠血清RF的影響均明顯高于單純造模組，但寒濕或濕熱環(huán)境之間無顯著性差異；試驗1月末，

10、造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清RF水平，但造模加寒濕或濕熱環(huán)境對大鼠血清RF水平的影響不明顯；造模加濕熱或寒濕環(huán)境能使大鼠血清RF水平在2周末達到高峰后，在1月末又顯著降低，但濕熱與寒濕環(huán)境之間無顯著性差異；單純造模使大鼠血清RF水平2周末達到高峰后，在1月末無明顯回落趨勢；正常組血清RF水平不隨時間的變化而改變?！　≡囼灨鹘M血清CRP檢測結果，試驗2周末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CRP水平，且造

11、模加濕熱環(huán)境對大鼠血清CRP的影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純造模組，造模加寒濕環(huán)境對大鼠血清CRP的影響也明顯高于單純造模組；試驗1月末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CRP水平，且造模加濕熱環(huán)境對大鼠血清CRP的影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純造模組，造模加寒濕環(huán)境對大鼠血清CRP的影響也明顯高于單純造模組；造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能使大鼠血清CRP水平在2周末達到高峰后，在1月末又顯著降低，但CRP降低的幅度三

12、種處理因素之間無顯著性差異；正常組血清CRP水平不隨時間的變化而改變?！　≡囼灨鹘M血清anti-CCP，RA33，APF，AKA檢測結果，試驗2周末，造模以及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CCP抗體水平，其中造模加寒濕或濕熱環(huán)境對大鼠血清CCP抗體的影響均明顯高于單純造模組，但兩種環(huán)境之間無顯著性差異；試驗1月末，造模以及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清CCP抗體水平，其中造模加寒濕或濕熱環(huán)境對大鼠血清CCP抗體的影

13、響均明顯高于單純造模組，但兩種環(huán)境之間無顯著性差異；試驗2周末，造模加濕熱環(huán)境能顯著升高大鼠血清RA33水平；單純造模及造模加寒濕環(huán)境對大鼠血清RA33的影響雖然有升高趨勢，但與正常組之間無顯著性差異；試驗1月末，造模及造模加寒濕或濕熱環(huán)境均能顯著升高大鼠血清RA33水平，但三種處理因素之間無顯著性差異；試驗2周末，造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能使大鼠血清APF的陽性程度明顯高于正常組，但三種處理因素之間無顯著性差異；試驗1月末，造模及

14、造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能使大鼠血清APF的陽性程度明顯高于正常組，其中造模加濕熱環(huán)境的陽性程度最高，造模加寒濕環(huán)境次之，但與單純造模無顯著性差異?！　≡囼?月末VEGF，IL-1陽性細胞檢測結果，造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能明顯增大大鼠VEGF，IL-1陽性細胞平均面積，但三種處理因素之間無顯著性差異，造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能顯著增大大鼠VEGF，IL-1陽性細胞MOD，且造模加濕熱環(huán)境對大鼠VEGF，IL-1陽性細胞MOD的

15、影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純造模組，造模加寒濕環(huán)境對大鼠VEGF，IL-1陽性細胞MOD的影響也明顯高于單純造模組；造模及造模加濕熱或寒濕環(huán)境均能顯著增多大鼠VEGF，IL-1的陽性細胞數(shù)，造模加濕熱環(huán)境對大鼠VEGF陽性細胞數(shù)的影響明顯高于造模加寒濕環(huán)境及單純造模組，造模加寒濕環(huán)境對大鼠VEGF陽性細胞數(shù)的影響也明顯高于單純造模組；造模加濕熱或寒濕環(huán)境對大鼠IL-1陽性細胞數(shù)的影響明顯高于單純造模組，但濕熱或寒濕環(huán)境之間對大鼠IL

16、-1陽性細胞數(shù)的影響無顯著性差異。　　HE染色病理結果，正常組關節(jié)結構正常，滑膜組織無炎性細胞浸潤，滑膜細胞無增生，骨及軟骨結構正常；模型組關節(jié)結構基本正常，滑膜細胞增生不明顯，骨及軟骨結構基本正常；寒濕組可見滑膜組織增生，可見3～4層排列不規(guī)則的滑膜細胞及炎性細胞浸潤，骨小梁稀疏，髓腔擴大；濕熱組滑膜細胞增生明顯，可見數(shù)層排列不規(guī)則的滑膜細胞，炎性細胞浸潤，骨小梁稀疏斷裂，排列不規(guī)則?！　〗Y論：環(huán)境因素使動物模型具有某些證候的某些

17、特征，可以作為制作中醫(yī)證候模型的手段之一。濕熱環(huán)境和寒濕環(huán)境對AA的影響，有顯著性差異，濕熱組動物一定程度上表現(xiàn)出了濕熱閉阻證的特征，如關節(jié)紅腫，甚至潰爛，多動，汗出，飲水量增加，呼吸急促，便干等；而寒濕環(huán)境對AA大鼠的影響也有寒濕痹阻證的某些特點，如關節(jié)腫脹，畏寒(相互擁擠在一起并鉆入墊料下取暖)，蜷臥少動，大便時軟時溏等；環(huán)境因素加重了動物模型的自身免疫反應，使病情加重。環(huán)境因素嚴重影響Ig，RF，CRP，anti-CCP，APF，

18、AKA以及VEGF和IL-1陽性細胞的表達，并加重了關節(jié)滑膜增生，炎性細胞浸潤，導致關節(jié)骨質(zhì)稀疏骨小梁斷裂。　　濕熱環(huán)境對IgA，IgM，RF，CRP，anti-CCP，APF，AKA，RA33以及VEGF陽性細胞數(shù)，MOD值，IL-1陽性細胞MOD值的影響比寒濕環(huán)境更嚴重，濕熱環(huán)境對關節(jié)病理學影響也較寒濕組嚴重，而寒濕環(huán)境對大鼠血清IgG影響更為顯著。　　寒濕環(huán)境與濕熱環(huán)境對RF，anti-CCP，VEGF和IL-1陽性細胞面積以