人IL-6高親和力拮抗肽的合理設(shè)計及功能評價.pdf

1、hIL-6是一種多功能的細胞因子，在諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。近年來，隨著對大量分子生物學(xué)突變實驗和晶體衍射結(jié)果的分析，科研工作者們不僅預(yù)測出了hIL-6/hIL-6R相互作用的重要功能活性位點，而且還根據(jù)這些相互作用的重要功能位點設(shè)計出了一系列有效的針對hIL-6的拮抗劑。本研究基于hIL-6/hIL-6R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，從理論上選定重要的功能活性位點(hIL-6的AB環(huán)以及螺旋-A、D的C末端)為靶標(biāo)，合理設(shè)計

2、出具有潛在功能的hIL-6拮抗肽，并選擇XG-7、M1細胞對其拮抗功能進行評價。 (1)基于hIL-6/hIL-6R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)合理設(shè)計hIL-6拮抗肽 基于hIL-6/hIL-6R復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，從理論上確定hIL-6與hIL-6R相互作用的重要區(qū)域。以hIL-6AB環(huán)區(qū)和螺旋A、D的C末端和為靶標(biāo)，合理設(shè)計出hIL-6拮抗肽PT。理論分析結(jié)果表明，拮抗肽PT在體外能夠有效地模擬hIL-6的作用競爭結(jié)合hIL-6

3、R。 (2)hIL-6R胞外段及突變體蛋白的表達、純化、功能及拮抗肽PT競爭hIL-6結(jié)合hIL-6R的評價 以eDNA-514為模板，將hIL-6R胞外段基因hIL-6R-EC05和缺失突變體hIL-6R-EC70(缺失Ig區(qū))定向克隆到原核表達載體pET32a(+)中，IPTG誘導(dǎo)表達后經(jīng)Ni2+鏊合柱純化，通過Westernblot進行鑒定。ELISA結(jié)合實驗證實Ig區(qū)在hIL-6R中僅起到穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用，對于

4、hIL-6和hIL-6R的作用影響不大。競爭ELISA結(jié)合實驗表明，拮抗肽PT在體外能夠有效地模擬hIL-6的作用競爭結(jié)合hIL-6R胞外段及其缺失突變體。 (3)選擇XG-7和M1細胞模型探討拮抗肽PT的生物學(xué)功能 ①利用細胞因子依賴株XG-7細胞(一種B細胞來源的hIL-6特異性依賴的細胞)對拮抗肽PT進行生物學(xué)功能評價。結(jié)果顯示，拮抗肽PT擁有潛在的生物學(xué)活性，能有效地阻斷hIL-6的功能，誘導(dǎo)XG-7細胞生長抑制

5、、促使其凋亡并呈劑量依賴性。 ②選用白血病M1細胞(在hIL-6的作用下生長會遭到抑制并誘發(fā)凋亡)為模型對拮抗肽PT進行生物學(xué)評價。結(jié)果顯示，拮抗肽PT能有效地保護M1細胞，使其在hIL-6作用下產(chǎn)生的生長增殖抑制和被誘導(dǎo)的凋亡得到一定的緩解。 總之，計算機輔助合理設(shè)計獲得的拮抗肽PT，經(jīng)實驗驗證具有一定的生物學(xué)活性，表現(xiàn)在能夠有效地阻斷hIL-6的功能，誘導(dǎo)或緩解細胞的生長增殖和凋亡。同時，本研究中利用M1細胞模型評價