應用體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)篩檢抗HBV活性中藥的實驗研究.pdf

1、目的：乙型肝炎是威脅人類健康的一種嚴重疾病，乙肝病毒（HBV）的感染在世界范圍內(nèi)廣泛流行，全球慢性HBV感染者約3.5億。我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，僅HBV攜帶者就達1.2億，其中慢性乙型肝炎患者有3000萬以上，但至今尚未取得治療上的根本突破。盡管已有干擾素及核苷類等抗HBV藥物，但長期應用可引起病毒耐藥，再度活躍病毒復制等諸多副反應。因此，尋找安全有效的抗HBV藥物已成為當今醫(yī)藥學界一項重要任務(wù)。近年來，中草藥抗HBV已成為國內(nèi)外的研

2、究熱點。中醫(yī)學認為乙型肝炎主要是由于濕熱之毒蘊積于肝所致，在治療上當以清熱解毒，疏肝利濕，健脾為主。諸多研究發(fā)現(xiàn)中藥在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝方面有明顯的臨床效應。本課題采用HBV基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞HepG2.117細胞模型篩檢單味中藥半枝蓮、珍珠草、女貞子和青蒿抑制HBsAg、HBeAg和HBV DNA的作用，為臨床中西醫(yī)結(jié)合治療肝病提供參考依據(jù)。
　　 方法：HepG2.117細胞培養(yǎng)，細胞長滿培養(yǎng)瓶后，用0.25％胰酶消化

3、，配成濃度1×105個細胞/ml，轉(zhuǎn)接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，置37℃含5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)，用DMEM完全培養(yǎng)基換液，3-4d后，細胞長滿培養(yǎng)板底，即可進行實驗。實驗分為9個組，含8個藥物組和1個空白對照組，其中，8個藥物組中含有4個單味中藥組、2個復方藥物組和2個陽性對照組。單味中藥分別為半枝蓮、珍珠草、女貞子和青蒿；復方藥物分別為枝蓮清肝膠囊和枝蓮清肝膠囊加拉米夫定；陽性對照藥物分別為拉米夫定和苦參素。實驗的每個組都設(shè)

4、3個平行孔，藥物組用含藥的培養(yǎng)基換液，空白對照組用DMEM完全培養(yǎng)基換液，每24h換1次，分別于用藥24h、48h、72h后收取細胞上清液，置-20℃保存?zhèn)錅y。采用Sargent JM等[6]建立的四甲基偶氮唑藍（MTT）比色分析法檢測藥物對細胞的毒性作用，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的水平，采用熒光定量PCR法檢測上清液HBV DNA的水平，從而評價藥物的抗HBV作用。
　　 應用

5、SASV8.1軟件進行統(tǒng)計學處理：計量資料用均數(shù)±標準差（x±SD）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：MTT比色OD值比較，藥物組與對照組間差異均無顯著性，提示所選濃度藥物對HepG2.117細胞生長無毒性作用。ELISA比色OD值比較，單味中藥組中，半枝蓮、珍珠草、女貞子與空白對照組HBsAg、HBeAg比較差異有顯著性（P<0.05）；復方藥物組中，枝蓮清肝膠囊和枝蓮清肝膠囊加拉米夫定與空白對照組HBsAg

6、、HBeAg比較差異有顯著性（P<0.05）；陽性對照組中，拉米夫定和苦參素與空白對照組比較均有顯著性差異（P<0.05）；而青蒿組與空白對照組比較無顯著性差異（P>0.05）。HBsAg比較，單昧中藥中，半枝蓮在24h和72h時抑制率最高，分別為27.98％和33.97％，珍珠草在48h時抑制率最高，為13.81％；復方藥物中，枝蓮清肝膠囊在24h和72h時抑制率最高，分別為30.05％和36.26％，枝蓮清肝膠囊加拉米夫定在48h時

7、抑制率最高，為24.69％；陽性對照中，拉米夫定在24h、48h和72h時抑制率均是最高，分別為35.75％、21.05％和40.08％。HBeAg比較，單味中藥中，半枝蓮在48h和72h時抑制率最高，分別為13.16％和23.48％，珍珠草在24h時抑制率最高，為5.77％；復方藥物中，枝蓮清肝膠囊加拉米夫定在24h、48h和72h時抑制率均是最高，分別為14.10％、11.58％和28.34％；陽性對照藥物中，拉米夫定在24h、48

8、h和72h時抑制率均是最高，分別為10.26％、13.68％和28.74％。HBV DNA比較，除青蒿組外，其他各實驗藥物組與空白對照組比較均有顯著性差異（P<0.05），其中單味中藥組中，半枝蓮的抑制率最高，為31.36％；復方藥物組中，枝蓮清肝膠囊加拉米夫定的抑制率最高，為42.01％；陽性對照藥物組中，拉米夫定的抑制率最高，為43.42％。
　　 結(jié)論：在1mg/ml濃度下，半枝蓮、珍珠草、女貞子三種單味中藥均有抑制HBV