兒童口腔變形鏈球菌遺傳多態(tài)性與乳牙齲關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的：齲病是世界范圍內(nèi)的常見(jiàn)病和多發(fā)病，被世界衛(wèi)生組織列為要重點(diǎn)防治的三大疾病之一。而其中乳牙齲又是兒童常見(jiàn)的多發(fā)病，不僅直接破壞兒童的咀嚼器官，還可影響兒童全身的營(yíng)養(yǎng)和發(fā)育，并導(dǎo)致頜面部發(fā)育障礙及各種口腔疾病，對(duì)小兒心理也造成不良影響。 本研究應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)同一幼兒園不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌的基因型進(jìn)行研究，探討不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株的遺傳多態(tài)性與乳牙齲的關(guān)系，從而為獲得完善齲危險(xiǎn)性預(yù)測(cè)的方法及預(yù)

2、防乳牙齲的發(fā)生提供有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床上快速檢測(cè)齲易感者奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1．選擇瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院幼兒園的50名3～5歲兒童，常規(guī)口腔檢查，記錄齲失補(bǔ)指數(shù)(decayed，missing，filledteeth index，dmft)、飲食情況、生活習(xí)慣和喂養(yǎng)史等。要求無(wú)全身系統(tǒng)性疾病，取樣前三個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，取樣前12小時(shí)內(nèi)不刷牙。其中：無(wú)齲組18例，中齲組16例，高齲組16例。不同齲敏感兒童分別

3、為：高齲者dmft≥6，中齲者6＞dmft≥4，無(wú)齲者dmft=0。用無(wú)菌刮匙刮取齲壞組織內(nèi)及附近的菌斑，對(duì)無(wú)齲者刮取釉質(zhì)窩溝及鄰面的菌斑，將刮取的菌斑置于盛有0.5ml硫乙醇酸鹽轉(zhuǎn)送液的EP管中，并且用液體石蠟20 μl覆蓋，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本經(jīng)漩渦混勻儀振蕩1 min，使菌斑細(xì)菌團(tuán)塊分散均勻，用磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution，PBS)做10倍系列稀釋后，分別接種于輕唾瓊脂(Mitis Saliv

4、arius．Agar，MS)平板上，37℃，厭氧培養(yǎng)(80％N2，10％CO2，10％H2)72 h后，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況，挑選菌落標(biāo)準(zhǔn)：形態(tài)為深藍(lán)色嵌頓，質(zhì)硬，表面粗糙，突起，邊緣不齊的典型變形鏈球菌菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢證實(shí)為呈短鏈狀、成對(duì)狀或分散排列的變形鏈球菌后，將變形鏈球菌單個(gè)菌落接種于MS平板上，37℃厭氧(80％N2，10％CO2，10％H2)條件下進(jìn)行次代純培養(yǎng)，48 h后，肉眼觀察無(wú)雜菌生長(zhǎng)，鏡檢證實(shí)為純培

5、養(yǎng)后，再次轉(zhuǎn)種至牛腦心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌，18 h后，再次經(jīng)鏡檢證實(shí)為純培養(yǎng)后，收集細(xì)菌，保種于盛有0.5 ml含50％甘油的Big培養(yǎng)基的EP管中，parafilm封口，-20℃冷藏備用。 2．為了排除如血鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌等在菌落形態(tài)上可能與變形鏈球菌混淆的細(xì)菌，每人隨機(jī)挑取3～6株臨床分離株，以變形鏈球菌ATCC25175為陽(yáng)性對(duì)照組，PBS為陰性對(duì)照組，所有臨床分

6、離株經(jīng)三次微量生化板進(jìn)行鑒定，并用革蘭氏染色法鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)，菌細(xì)胞形態(tài)呈短鏈狀、成對(duì)狀或分散排列。 3．提取細(xì)菌染色體的DNA，采用基因組DNA快速提取試劑盒分別提取每個(gè)分離株的DNA。由于提取得到的DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)，而且核酸抽提中常用的試劑都能使．A260和A280的值變大，但是卻可能使二者的比值與高純度核酸的比值一致，因此測(cè)DNA的A260/A280比值可估計(jì)某一核酸溶液的純

7、度，取少量DNA在核酸蛋白測(cè)定儀下測(cè)定其濃度和純度。以5'-TGCCGAGCTG-3'為引物，采用隨機(jī)引物聚合酶鏈反應(yīng)法(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction，AP-PCR)對(duì)不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體積為25μl，其中包括20 mM Tris-HC1，每種dNTP各500μmol/L，3 mmol/LMgCl2，0.1 U Taq聚合酶，100 m

8、M KCL，0.3 μmol/L引物，DNA 2～40 ng，不足部分用ddH2O補(bǔ)齊，以臨床分離株染色體DNA為反應(yīng)模板，在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)(94℃1 min，36℃2 min，72℃2 min)后，72℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后，取10 μl反應(yīng)混合物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠(已加EB)電泳35～50 min，電泳液為TBE緩沖液，電壓100～120 V，以Lambda DNA/

9、EcoRⅠ+HindⅢ標(biāo)記分子量參照標(biāo)準(zhǔn)，在凝膠分析儀上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物帶型。并以不同稀釋度的變形鏈球菌臨床分離株染色體DNA為模板，進(jìn)行AP-PCR重復(fù)性的檢測(cè)。 4．對(duì)不同齲敏感性的組別和其所攜帶不同種基因型的數(shù)量之間的關(guān)系用SPSS 13.0軟件進(jìn)行卡方分析。 結(jié)果： 1．經(jīng)初代培養(yǎng)的50例個(gè)體的菌斑樣本中，有29例個(gè)體培養(yǎng)出變形鏈球菌，檢出率為58％，其中高齲者12例，占24％，中齲者9例，占18％，無(wú)齲者8

10、例，占16％。培養(yǎng)皿中可觀察到典型變形鏈球菌菌落形態(tài)即呈深藍(lán)色嵌頓，質(zhì)硬，表面粗糙，突起，邊緣不齊的菌落，用革蘭氏染色法鏡檢，菌細(xì)胞形態(tài)呈短鏈狀、成對(duì)狀或分散排列。21名未培養(yǎng)出變形鏈球菌的個(gè)體中，有15名是無(wú)齲個(gè)體，6名是中齲個(gè)體。經(jīng)純培養(yǎng)共獲得純培養(yǎng)變形鏈球菌29例共119株，其中無(wú)齲組8例35株，中齲組9例38株，高齲組12例46株。 2．由于血鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌等在菌落形態(tài)上可能與變形鏈球菌相混淆，對(duì)119株變形鏈球菌臨

11、床株進(jìn)行三次生化鑒定，結(jié)果在119株變形鏈球菌臨床分離株中篩選出111株變形鏈球菌，其中無(wú)齲組8例31株，占27.93％；中齲組9例36株，占32.43％；高齲組12例44株，占39.64％。 3．111株變形鏈球菌DNA的A260/A280比值為1.7～1.9之間，說(shuō)明提取的變形鏈球菌DNA濃度及純度較高，蛋白質(zhì)沒(méi)有污染。采用AP-PCR對(duì)不同齲敏感兒童口腔變形鏈球菌臨床分離株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后在凝膠分析儀上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物帶

12、型，肉眼觀察如果10條帶譜中有9條相同，即認(rèn)為兩個(gè)菌株的基因型相同。在所獲取的111株變形鏈球菌臨床分離株中，共有33種基因型，其中12例高齲個(gè)體中有2例為1種基因型，9例有2種基因型，1例有3種基因型；9例中齲個(gè)體中有8例為1種基因型，1例有2種基因型；8例無(wú)齲個(gè)體中全部為1種基因型。在確立的最佳AP-PCR反應(yīng)條件下，用同一臨床分離株染色體DNA為擴(kuò)增模板，在不同時(shí)間，以不同稀釋度的變形鏈球菌臨床分離株染色體DNA為模板，進(jìn)行AP-

13、PCR重復(fù)性的檢測(cè)，產(chǎn)生了相同的擴(kuò)增產(chǎn)物帶型，所得的電泳帶型均一致。 4．對(duì)不同齲敏感性的組別和攜帶不同種基因型數(shù)量之間的關(guān)系用SPSS 13.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，x2=19.325，P=0.001<0.01(α=0.05，υ=4)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： (1)對(duì)符合標(biāo)準(zhǔn)的個(gè)體共50例，用MS培養(yǎng)基可獲得純培養(yǎng)變形鏈球菌29例共119株：無(wú)齲組8例35株，中齲組9例38株，高齲組12例46株。采用微量生化板法

14、對(duì)29例共119株變形鏈球菌臨床株進(jìn)行生化鑒定，其中有111株為變形鏈球菌，無(wú)齲組8例31株，占27.93％；中齲組9例36株，占32.43％；高齲組12例44株，占39.64％。 (2)AP-PCR基因指紋技術(shù)能獲得變形鏈球菌的條帶模式圖即基因指紋圖譜，擴(kuò)增的條帶清晰；對(duì)在不同時(shí)間，以不同稀釋度的變形鏈球菌臨床分離株染色體DNA進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AP-PCR重復(fù)性好。 (3)敏感性越高的組別其所攜帶的基因型的數(shù)量也越多