新藥用資源—鉤藤葉化學(xué)成分及生物活性的研究.pdf

1、鉤藤葉為茜草科鉤藤屬植物鉤藤的干燥葉。本論文采用現(xiàn)代天然藥物研究方法，對新藥用資源-鉤藤葉化學(xué)成分、藥理活性和質(zhì)量分析方法等進(jìn)行了系統(tǒng)研究。 通過硅膠柱色譜、SephadexLH-20柱色譜、開放ODS柱色譜、制備HPLC色譜等多種色譜分離手段，從鉤藤葉75％乙醇提取物的氯仿和正丁醇萃取物中，分離得到25個化合物。通過理化常數(shù)測定、波譜測定分析等方法，鑒定了它們的結(jié)構(gòu)，分別是：18，19-二去氫科諾新酸B(18，19-dehyd

2、rocorynoxinicacidB，1)，18，19-二去氫科諾新酸(18，19-dehydrocorynoxinicacid，2)，11-羥基喜果苷2'-O-β-D-葡萄糖苷(11-hydroxy-2'-O-β-D-glucopyranosylvincosidelactam，3)，異去氫鉤藤堿酸22-O-β-D-葡萄糖苷(22-O-β-D-glucopyranosylisocorynoxeinicacid，4)，去氫鉤藤堿氮氧化物(

3、corynoxeine-N-oxide，5)，鉤藤堿(thynchophylline，6)，異鉤藤堿(isorhynchophylline，7)，去氫鉤藤堿(corynoxeine，8)，異去氫鉤藤堿(isocorynoxeine，9)，鉤藤堿氮氧化物(thynchophylline-N-oxide，10)，異鉤藤堿氮氧化物(isorhynchophylline-N-oxide，11)，異去氫鉤藤堿氮氧化物(isocorynoxeine

4、-N-oxide，12)，喜果苷(vincosidelactam，13)，異胡豆苷(strictosidine，14)，二氫柯楠因堿(dihydrocorynantheine，15)，槲皮素-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranosid，16)，蘆丁(rutin，17)，金絲桃苷(hyperoside

5、，18)，山柰酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃半乳糖苷(kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranoside，19)，三葉豆苷(trifolin，20)，6β-羥基烏蘇酸(6β-hydroxyursolicacid，21)，3β，6β，19α-trihydroxyurs-12-en-28-oicacid(22)，3β，6β，23-trihyd

6、roxyurs-12-en-28-oicacid(23)，β-谷甾醇(β-sitosterol，24)，胡蘿卜苷(daucosterol，25)。其中1-5為未見文獻(xiàn)報道的新化合物，化合物14、16、19和21為首次從該屬植物中分離得到，化合物17和25為首次從該種植物中分離得到。 采用LPS刺激的大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞及小鼠N9小膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨Ｐ?，以小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放量為評價指標(biāo)，篩選出鉤藤葉提取物的氯仿萃取物為抑制小膠質(zhì)細(xì)胞

7、活化活性部位群，測定了從鉤藤葉分離的15種氧化吲哚和吲哚類生物堿化合物抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化活性。結(jié)果表明：鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等氧化吲哚生物堿及喜果苷和異胡豆苷等吲哚生物堿苷均可顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化。鉤藤堿類氧化吲哚生物堿對小膠質(zhì)細(xì)胞活化抑制作用構(gòu)效關(guān)系解析如下：N4位叔胺基是鉤藤堿類氧化吲哚生物堿抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化活性的必要結(jié)構(gòu)，形成氧化物后，將失去活性；7S構(gòu)型和C18-C19位雙鍵對抑制活性有增強(qiáng)作用。

8、采用ELISA法測定了鉤藤堿和異鉤藤堿對LPS激活的N9小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子釋放的抑制作用，二者均對LPS激活的N9小膠質(zhì)細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)顯示了較強(qiáng)的抑制作用，且7S構(gòu)型的異鉤藤堿活性(IC50：2.35和3.29μM)強(qiáng)于7R構(gòu)型的鉤藤堿(IC50：12.1和6.09μM)。Westernblotting測定結(jié)果提示鉤藤堿和異鉤藤堿抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號傳導(dǎo)通路涉及到下調(diào)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶

9、MAPK-ERK和MAPK-p38磷酸化和抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)抑制蛋白(ⅠκB)的降解，進(jìn)而抑制誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表達(dá)等。比較二者對不同信號傳導(dǎo)因子的抑制活性強(qiáng)度，鉤藤堿下調(diào)MAPK-p38磷酸化作用略強(qiáng)于異鉤藤堿，而異鉤藤堿對MAPK-ERK磷酸化、ⅠκB降解和iNOS蛋白表達(dá)等信號傳導(dǎo)因子抑制作用則強(qiáng)于鉤藤堿。 建立了HPLC-UV和LC-MS定性和定量分析鉤藤葉與鉤藤藥材中14種生物堿成分的方

10、法。方法學(xué)考察表明：方法重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于鉤藤葉與鉤藤藥材多指標(biāo)生物堿類成分指紋圖譜分析和定量分析。采用HPLC-UV法測定了8批鉤藤葉與鉤藤藥材中14種生物堿類成分的含量，結(jié)果表明，鉤藤葉中生物堿類成分的種類與鉤藤是相似的，但各成分含量差異較大。鉤藤葉生物堿主體成分是吲哚類生物堿苷喜果苷，其平均含量(0.33％)約為鉤藤樣品平均含量(0.02％)的16倍，且葉中異胡豆苷和11-圣基喜果苷2'-O-β-D-葡萄糖苷等吲哚型生物堿

11、苷平均含量(0.25％和0.04％)均高于鉤藤(0.04％和0.02％)。鉤藤的生物堿主體成分是鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿和異去氫鉤藤堿等氧化吲哚型生物堿，平均含量分別為0.13％、0.21％、0.11％和0.20％。在總生物堿含量上，鉤藤葉與鉤藤接近或含量稍高。 綜上所述，鉤藤葉主要含有生物堿、黃酮和三萜等成分。其中，鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、喜果苷和異胡豆苷為其主要生物堿類成分，微量生物堿類成分包括鉤藤堿

12、氮氧化物、異鉤藤堿氮氧化物、去氫鉤藤堿氮氧化物和異去氫鉤藤堿氮氧化物等。鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、異去氫鉤藤堿、喜果苷和異胡豆苷等可顯著抑制LPS活化的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放神經(jīng)毒性物質(zhì)，從而對活化的小膠質(zhì)細(xì)胞造成的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，是鉤藤葉抗小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究對從鉤藤堿類生物堿中尋找以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化為靶點治療神經(jīng)退行性疾病的藥物提供了化學(xué)和藥理學(xué)依據(jù)。鉤藤葉作為擴(kuò)大鉤藤藥用部位的候選資源和鉤藤類生物堿的資源植物