LMP-3基因轉(zhuǎn)移對骨髓間充質(zhì)干細胞的調(diào)節(jié)作用及其用于治療骨缺損的研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷、疾病所造成的骨缺損是骨科治療的難題之一，隨著DNA重組技術(shù)及基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、組織工程技術(shù)的進展，骨缺損的治療得到了迅速發(fā)展。LMP是最近發(fā)現(xiàn)的一個骨生成誘導(dǎo)蛋白，其中LMP-1和LMP-3具有成骨作用，是成骨細胞分化的正調(diào)節(jié)因子，可以促進多種骨誘導(dǎo)因子的分泌，促進骨鈣素的分泌和骨結(jié)節(jié)的形成，主要在骨的礦化過程中發(fā)揮重要作用。本研究借助組織工程技術(shù)，構(gòu)建LMP-3真核表達質(zhì)粒，研究其對骨髓間充質(zhì)干細胞表型變化的影響，以明膠海綿為

2、支架，體內(nèi)研究其成骨作用，探討其對骨缺損的修復(fù)作用。 方法：應(yīng)用PCR技術(shù)擴增LMP-3的功能區(qū)序列，亞克隆至真核表達質(zhì)粒pEGFP-N1，最終構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pEGFP-N1-LMP-3，同時進行酶切簽定和測序；培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察LMP-3對骨髓間充質(zhì)干細胞表型變化的影響，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LMP-3，應(yīng)用RT-PCR檢測骨生長標(biāo)志基因LMP-3、OCN、Type Collagen I、ALP、Bsp的表達

3、，生化檢測堿性磷酸酶的活性，放免法檢測骨鈣素的表達，以茜素紅染色法觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況，應(yīng)用免疫組化的方法檢測Type Collagen I的表達；制做兔橈骨缺損的動物模型，以明膠海綿為支架，復(fù)合轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LMP-3的骨髓間充質(zhì)干細胞，移植至骨缺損部位，以x線觀察骨缺損的愈合情況，以HE染色觀察組織的生長狀態(tài)、成骨細胞和成纖維細胞的分布。 結(jié)果：1、PCR擴增LMP-3基因序列正確，構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pEGFP-N

4、1-LMP-3經(jīng)EcoRl和Hind3雙酶切測序鑒定正確。2、兔骨髓間充質(zhì)干細胞可以成功培養(yǎng)，經(jīng)pEGFP-N1-LMP-3轉(zhuǎn)染后，骨髓間充質(zhì)干細胞可以表達成骨生長標(biāo)志基因OCN、Type Collagen I、ALP、Bsp，生化檢測到ALP的表達，礦化結(jié)節(jié)染色陽性，放免法檢測到了OCN的表達，免疫組化發(fā)現(xiàn)聊Type Collagen I的表達明顯增強；而對照組除Type Collagen I有輕度表達外，其余皆為陰性結(jié)果。3、成功建

5、立了免橈骨缺損的動物模型，實驗組X線和組織學(xué)觀察皆證實了骨缺損的修復(fù)，實現(xiàn)了骨性連接，但明膠海綿移植組和單純細胞移植組沒有見骨缺損的愈合，骨斷端間為纖維組織連接。 結(jié)論：成功獲得真核表達重組質(zhì)粒pEGFP-N1-LMP-3，為進一步研究其成骨功能奠定了基礎(chǔ)；轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-LMP-3后，骨髓間充質(zhì)干細胞可以分泌成骨生長標(biāo)志基因，LMP-3功能區(qū)可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的表型轉(zhuǎn)換，LMP-3功能區(qū)同其全長cDNA一