口腔粘膜下纖維性變相關(guān)miRNA表達譜的建立及其功能的初步探討.pdf

1、研究背景及目的:
　　口腔粘膜下纖維性變(oral submucous fibrosis,OSF)是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的口腔粘膜病,癌變率高達7.6％。最近的流行病學(xué)調(diào)查表明,OSF的發(fā)病地區(qū)、發(fā)病率和癌變率均有上升趨勢。目前認為OSF與咀嚼檳榔、膠原代謝紊亂、免疫、遺傳、微循環(huán)及血液流變學(xué)等因素有關(guān),本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療具有明顯的臨床效果,但口腔粘膜下纖維性變的確切發(fā)病機制及治療顯效獲得的

2、機制仍不清楚。
　　miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子,參與了機體生長發(fā)育,器官形成,造血,細胞增殖、分化及凋亡等眾多生理活動和病理過程。近年來miRNA在心肌纖維化、腎臟纖維化和肝纖維化等方面已有許多報道,至于miRNA在OSF發(fā)病中的功能及機制研究報道較少。本研究旨在探討miRNA在OSF發(fā)病及臨床治療轉(zhuǎn)歸中的功能及作用機制,為闡明OSF的發(fā)病機理及臨床治療提供新的線索。
　　研究方

3、法:
　　(1)選取2例臨床上具有典型病理特征的中期OSF組織及其配對正常組織,以正常組織為對照,部分病變組織行Affvmetrix miRNA芯片實驗,建立OSF相關(guān)miRNA表達譜。原配對組織及選取的初診OSF配對中、晚期各10例組織經(jīng)miRNA專用抽提試劑盒抽提miRNA后,經(jīng)專用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后,用實時定量PCR驗證miRNA芯片結(jié)果。
　　(2)針對感興趣的miRNA,根據(jù)下列三個國際公認的、擁有不同

4、計算方法的數(shù)據(jù)庫:www.targetscan.org、pictar.mdc-berlin.de/cgibin/PicTar-vertebrate.cgi、www.mirbase.org進行miRNA靶標(biāo)的初步預(yù)測,尋找三個數(shù)據(jù)庫都預(yù)測為靶的基因。
　　(3)從正?？谇徽衬そM織獲得原代成纖維細胞,以檳榔堿(50μg/ml)誘導(dǎo),于24h,48h,72h檢測差異miRNA的表達。原代培養(yǎng)OSF-Fb細胞,經(jīng)丹參(90mg/ml)聯(lián)合

5、小劑量潑尼松龍作用,于24h,48h,72h后檢測差異miRNA的表達。
　　(4)通過生物信息學(xué)軟件對miR-203可能調(diào)控的靶基因進行預(yù)測,結(jié)合其生物學(xué)功能,篩選出miR-203可能的靶基因COL4A4。Western blot檢測上述收集的配對標(biāo)本組織、檳榔堿誘導(dǎo)前后的正常口腔粘膜成纖維細胞及丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍?zhí)幚砬昂蟮腛SF-Fb細胞中COL4A4的表達。
　　(5)將COL4A4基因3’UTR包括miR-203

6、結(jié)合位點、上下游部分側(cè)翼序列以及酶切位點在內(nèi)的共60bp片段分別克隆入pMIR-REPORT熒光素酶報告基因載體,將其分別與β-gal表達質(zhì)粒及miR-203表達載體共轉(zhuǎn)染293T細胞24h后檢測報告基因活性。
　　結(jié)果:
　　(1)所選病變組織屬于OSF病變中期,miRNA芯片顯示差異1.5倍以上的miRNA共有18個,其中OSF病變組織中上調(diào)12個,下調(diào)6個,miRNA特異性實時定量PCR驗證結(jié)果與芯片結(jié)果一致;

7、　　(2)臨床中、晚期OSF組織中差異miRNA的變化趨勢與芯片結(jié)果基本一致;(3)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示其中的miR-203、miR-23b及miR-200c等可能參與了OSF病變過程及其后的癌變;(4)檳榔堿能誘導(dǎo)正常口腔粘膜成纖維細胞中miRNA的表達改變,丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍能逆轉(zhuǎn)OSF成纖維細胞中相關(guān)miRNA的表達;(5)生物信息預(yù)測顯示COL4A4基因3’UTR與miR-203之間有一物種間保守作用位點(site1),3

8、個非保守作用位點(site2,site3,site4);(6)OSF組織中,COL4A4的蛋白表達量明顯高于配對正常組織,檳榔堿能誘導(dǎo)上調(diào)正常口腔粘膜成纖維細胞中COL4A4的表達,而丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍能下調(diào)OSF成纖維細胞中COL4A4的表達;(7)miR-203能明顯抑制site1介導(dǎo)的報告基因活性,能部分抑制site2與site4介導(dǎo)的報告基因活性,而對site3介導(dǎo)的報告基因活性無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　(1