臨床分離嗜麥芽窄食單胞菌喹諾酮耐藥基因、產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶耐藥基因的研究.pdf

1、目的：
　　嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，Sm）屬于非發(fā)酵菌，是一種專性需氧的G－桿菌，廣泛存在于自然界，如：各種水源、牛奶、土壤、動物及人體等；醫(yī)院環(huán)境如透析裝置、中心動/靜脈壓檢測儀、霧化吸入、人工呼吸裝置及通氣管道等亦可分離到該菌。近10年來，Sm臨床分離率呈明顯上升趨勢，已成為院內感染的重要病原菌，可引起肺炎、腦膜炎、心內膜炎、蜂窩組織炎、尿道及傷口感染、菌血癥及敗血癥等；該菌

2、對多種廣譜抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來很大困難。因此，對其耐藥機制、耐藥基因的傳播與轉移的研究已引起廣泛關注，成為近年來該領域研究的熱點。
　　本課題通過對喹諾酮耐藥基因Smqnr、產(chǎn)氨基糖苷類修飾酶基因APH(3’’)-Ⅰ和AAC(2’)-Ⅰ的克隆測序及表達，為進一步進行Smqnr蛋白高級結構測定的結晶試驗提供必須材料，同時為了解上述基因表達產(chǎn)物的特性及功能奠定基礎，從分子水平開展醫(yī)院Sm耐藥株感染的控制和監(jiān)測提供依據(jù)。

3、　　方法：
　　采用離心柱型DNA抽提純化試劑盒提取Sm染色體DNA，根據(jù)Genbank公布的序列設計特異性引物，以染色體DNA為模板，通過PCR技術擴增Smqnr、APH(3’’)-Ⅰ和AAC(2’)-Ⅰ全基因，PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌E.coli DH5a,挑取經(jīng)氨芐篩選的陽性菌落提取質粒并經(jīng)雙酶切鑒定及進行測序。以證實含目的基因的質粒DNA為模板大量擴增目的基因并將其亞克隆入高效原核融合

4、蛋白（GST）表達載體pGEX-4T-1,轉化大腸桿菌E.coli BL21,經(jīng)雙酶切鑒定后以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導重組菌表達，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）及免疫印跡法（Western blot）分析表達結果。
　　結果：
　　以染色體DNA為模板，PCR擴增出三個大小分別約650bp、800bp和520bp左右的片段并將其成功克隆入T載體。序列比對分析顯示Smqnr開放閱讀框

5、長660bp，編碼24.3kDa蛋白；APH(3’’)-Ⅰ開放閱讀框長813bp，編碼29.9kDa蛋白；AAC(2’)-Ⅰ開放閱讀框長549bp，編碼20.2kDa蛋白。三個基因的序列已登錄GenBank，登錄號分別為HQ315851、HQ315852和HQ315853。成功構建高效表達載體pGEX-4T-1-Smqnr/ APH(3’’)-Ⅰ/AAC(2’)-Ⅰ，經(jīng)IPTG誘導分別獲得分子量約50kDa、56kDa、46kDa的融合