杜仲葉、梔子提取物制備分析及其減肥調(diào)脂作用機(jī)制初探.pdf

1、目的：制備杜仲葉提取物（EE）及梔子提取物(GE)并進(jìn)行定量及定性分析；觀察EE、GE及其合用對小鼠腹腔注射葡萄糖耐量和靜脈脂質(zhì)耐受的影響；體外評價藥物及其主要組分（綠原酸、西紅花苷、京尼平苷）對胰脂肪酶活性的影響及其協(xié)同作用，并觀察各藥對脂質(zhì)積聚人肝癌 HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。探討EE和GE調(diào)脂減肥的作用機(jī)制，為肥胖癥和高脂血癥等代謝性疾病的防治提供新的候選藥物。
　　方法：
　　1.利用NKA-9和

2、HPD-100型大孔樹脂分別對杜仲葉及梔子粗提物分離純化，UPLC測定EE中綠原酸（CGA）及GE中京尼平苷（GPS）含量，UV測定GE中西紅花苷總苷（CRN)含量，并用LC-MS對EE、GE進(jìn)行定性分析。
　　2.雄性小鼠隨機(jī)分9組（每組8只）：正常對照組（Normal）、模型組（Model）、辛伐他汀組（Sim）、杜仲葉提取物高（EEH）/低（EEL）劑量組、梔子提取物高（GEH）/低（GEL）劑量組和聯(lián)用高(EEH+GEH)

3、/低(EEL+GEL)劑量組。各組小鼠給予0.5％CMC-Na溶液或相應(yīng)劑量藥物灌胃6d。末次給藥禁食2h后，正常組小鼠注射生理鹽水，其余各組尾靜脈注射10％英特利匹特脂肪乳和腹腔注射20％葡萄糖溶液，并分別于注射0min、5min、15min、30min、60min尾靜脈采血，檢測甘油三酯（TG）、膽固醇(TC)、葡萄糖（GS）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）。
　　3.以奧利司他為陽性對照，采用銅皂法檢

4、測各藥及其主要組分對胰脂肪酶的抑酶活力（IC50），并根據(jù)IC50配比藥物測定酶活，金式公式計算各藥間的協(xié)同作用。4. MTT法確定EE/GE及其主要組分（CGA，GPS，CRN）的干預(yù)劑量。油酸誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立脂質(zhì)積聚模型，以二甲雙胍（Met）和辛伐他?。⊿im）為陽性對照，使用各藥或其聯(lián)合干預(yù)細(xì)胞模型24h后，油紅O染色觀察各組細(xì)胞內(nèi)脂滴積聚，并復(fù)溶細(xì)胞定量分析總脂質(zhì)含量；試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量；Western Blo

5、t分析細(xì)胞內(nèi)T-AMPKα、P-AMPKα及PPARα蛋白的表達(dá)，并觀察預(yù)先加入Compound C對AMPKα蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.UPLC測定EE中CGA含量為52.3%，GE中GPS含量為52.5%，UV測得GE中CRN含量為10.5%。經(jīng)LC-MS定性分析顯示EE中主要含有CGA、蘆丁及金絲桃苷，GE中主要含有GPS、西紅花苷-1/2及京尼平龍膽二糖苷。
　　2. EEH(400mg/kg?d)

6、、GEH(400mg/kg?d)、EEH+GEH(400mg/kg?d+400mg/kg?d)的曲線下面積（AUC）顯著低于模型組，均能顯著加快小鼠血清TG和GS代謝速率，且合用表現(xiàn)出協(xié)同作用。
　　3.除GPS抑酶作用不明顯外，其余藥物均具有一定抑酶活性，其IC50如下： CGA=6572.38μg/mL，CRN=434.65μg/mL，EE=878.93μg/mL，GE=911.31μg/mL。通過金氏公式計算顯示CRN+GP

7、S（1/2 IC50CRN:2.5IC50 CRN）和CRN+CGA（1/2 IC50:0.46 IC50）Q值分別為1.17和1.25，表現(xiàn)出顯著協(xié)同作用。但各組藥物抑酶強(qiáng)度均不如奧利司他（IC50=23.56μg/mL）。
　　4. MTT法確定細(xì)胞培養(yǎng)濃度為2×104個/孔，并最終選擇干預(yù)藥物濃度分別為： CRN：10μM，CGA:30μM，GPS:10μM，GE:160mg/L，EE:80mg/L，GE+EE：160mg/

8、L+80mg/L，CRN+CGA：10μM+30μM。油紅O染色發(fā)現(xiàn)各藥物均能減少細(xì)胞內(nèi)脂滴。對細(xì)胞內(nèi)總脂質(zhì)及TG、TC定量分析發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，除Met外其余各組均能顯著減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。Western Blot分析各組T-AMPKa、P-AMPKa及PPARa蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)：比較模型組，CRN、CRN+CGA、GE、EE、GE+EE能顯著增加T-AMPKα表達(dá)量；除GPS外其余各藥均顯著增強(qiáng)P-AMPKα表達(dá)量；各用藥組P-AMP

9、Kα/T-AMPKα比值均顯著高于模型組；但上述P-AMPKα及T-AMPKα蛋白的顯著變化均能被Compound C抑制；與模型組比較，除GPS外其他藥物均顯著增強(qiáng)PPARα表達(dá)量；相關(guān)性分析顯示PPARα表達(dá)水平與P-AMPKα表達(dá)量成高度正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)大孔樹脂分離純化，UPLC和UV定量分析得到EE（CGA含量為52.3%）和GE（GPS含量為52.5%，CRN含量為10.5%）；
　　2.EE

10、/GE單用及聯(lián)用能加快小鼠TG和GS清除速度，增強(qiáng)小鼠糖脂的耐受能力且呈現(xiàn)量效關(guān)系，EE+GE表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用；
　　3.EE/GE及主要組分（CGA和CRN）均對胰脂肪酶活性有一定的抑制作用，且CRN+GPS（1/2 IC50CRN:2.5IC50 CRN）和CRN+CGA（1/2 IC50:0.46 IC50）表現(xiàn)出顯著協(xié)同作用；
　　4. EE/GE及主要組分（CGA，CRN)均能減少油酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積