潰瘍性結腸炎分子標志物的篩查和發(fā)病機制的初步探討.pdf

1、背景、目的:潰瘍性結腸炎(UC)是炎癥性腸病(IBD)的一個主要類型，是一種原因不明的慢性非特異性腸道炎癥1。病變主要限于結腸的黏膜層和粘膜下層，以潰瘍和隱窩膿腫為主要特點，多累及直腸和乙狀結腸，也可遍及整個結腸2。臨床表現(xiàn)主要是腹瀉、粘液膿血便、腹痛。病情輕重不等，多呈反復發(fā)作的慢性病程3,4。本病可以發(fā)生在任何年齡，多見于20-40歲5，亦可見于兒童或老年。男女發(fā)病率無顯著差別。病理特點是粘膜的彌漫性炎癥，固有膜內(nèi)彌漫性淋巴細胞、漿

2、細胞、單核細胞等炎細胞浸潤，活動期有大量中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，可發(fā)生隱窩炎和隱窩膿腫。上世紀六十年代英國科學家Morson從病理學特征上將它與克羅恩病(CD)加以區(qū)分并將其界定為獨立的疾病。該病在歐美國家較常見，歐洲20個中心調查顯示UC的年發(fā)病率為11.2/10萬，以往發(fā)病率較低的東方國家，近年也呈現(xiàn)增高趨勢。我國1981-2000年間共計報道UC病例10218，近10年該病報道數(shù)上升3.1倍6。我國目前暫缺乏大規(guī)模的流行病學

3、調查，但粗略估計UC發(fā)病率為11.6/10萬7，而且有證據(jù)表明成逐年上升趨勢8-10。而且，潰瘍性結腸炎是一種癌前病變11，與結腸癌的發(fā)病有關12，且病程長，病變程度輕重各異，由于病因不明，臨床上常常表現(xiàn)反復發(fā)作而治愈難度大13，14，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一15。要達到UC治愈的目的，早期發(fā)現(xiàn)及發(fā)病機制的研究至關重要16。
　　 盡管深入到分子生物學、基因水平甚至蛋白水平的研究方法，使得潰瘍性結腸炎的發(fā)病機制的研究取得

4、了突飛猛進的發(fā)展;必須明確潰瘍性結腸炎是多因素參與的復雜疾病，單基因或蛋白質標記物無法全面而準確地反映其復雜的發(fā)病機制。因此需要運用基因組、轉錄組和蛋白質組等高通量技術來尋找由多基因或蛋白質組成的復合型標記物，以期更準確、敏感地預測疾病，并深入闡釋其發(fā)生發(fā)展的分子機制。都知道基因組水平的研究，主要集中在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和基因的擴增、缺失，轉錄組的研究重點是在mRNA水平檢測基因的表達變化，可以高通量地檢測組織或細胞樣本中全基因的mRNA水

5、平，建立基因表達譜，從而確定一組表達量與疾病相關的基因(Gene signature)，用于疾病預測和預后評估。與基因組水平的研究相比，Gene signature更具實用性。而蛋白質組則不僅研究基因的蛋白產(chǎn)物豐度，還注重檢測蛋白質翻譯后修飾及其對蛋白功能的影響。這三個層次的研究并不孤立，都反映了差異基因的豐度和表達變化，三個層次的研究結果可以相互印證，互為補充。
　　 前期首先運用雙向電泳和質譜技術，比較12例潰瘍性結腸炎和1

6、2例正常組織的蛋白質表達譜，從中鑒定出30種差異表達蛋白質。進一步利用生物信息學方法，找到11種與P38MAPK通路相關的差異表達蛋白質，并將這11種蛋白與該通路的關鍵蛋白質組成一個差異蛋白質簇。用Western Blot技術在上述樣本中初步驗證了此差異蛋白質簇與潰瘍性結腸炎的相關性。然后從該蛋白質簇中選取了兩種蛋白，Galectin-3和MAWBP，用免疫組化技術在56例潰瘍性結腸炎和正常樣本中檢測其豐度。發(fā)現(xiàn)Galectin-3和M

7、AWBP在潰瘍性結腸炎組織中表達顯著降低(x2=31.404，P=0.000;x2=20.541，P=0.000)，并與炎癥程度特異相關(x2=12.315，P=0.002; x2=8.726，P=0.018)。
　　 本研究中，擬在前期試驗結果的基礎上，進一步探討P38MAPK與潰瘍性結腸炎的相關性和調控機制，并進一步擴大樣本量研究差異蛋白簇中抽提出的蛋白質印記作為潰瘍性結腸炎分子標志物的可能性。針對此蛋白印跡中的一種與潰瘍性

8、結腸炎密切相關的新蛋白MAWBP，對此產(chǎn)生了濃厚的興趣，利用基因組學和多種分子生物學技術結合對其生物學功能及與潰瘍性結腸炎的關系進行了研究。還進一步利用基因組學分析了潰瘍性結腸炎反復遷延不愈的復雜機制，找到了重要的腫瘤相關基因，從而為潰瘍性結腸炎癌前病變提供了候選標志物及有希望的新治療靶點。
　　 方法:
　　 1、運用Westem Blot和ELISA技術，在巨噬細胞系RAW264.7中驗證前期蛋白組學得到的差異蛋白簇

9、受P38MAPK信號通路的調控，用免疫組化技術檢測118例樣本中差異蛋白簇磷酸化P38、Galectin-3和MAWBP的表達并分析其與潰瘍性結腸炎臨床特點的相關性和作為復合標志物的可能性。
　　 2、運用Microarray和多種分子生物學方法揭示差異蛋白MAWBP在潰瘍性結腸炎中的作用、功能和分子機制。首先通過免疫組化和Western Blot檢測MAWBP結合蛋白MAWD在潰瘍性結腸炎中的表達和定位，進而通過免疫共沉淀實驗

10、確定兩者相互結合。通過構建真核表達載體轉染Caco-2細胞來分別及共同高表達MAWBP和MAWD，Microarray技術分析其基因表達譜，進而通過Real-time PCR和Western Blot驗證差異基因。最后通過干擾RNA技術敲低MAWBP和MAWD的表達，進一步從反方向驗證MAWBP和MAWD與ERK通路的關系。
　　 3、運用DASL技術在轉錄水平對潰瘍性結腸炎活動期和靜止期的基因表達譜進行分析，挑選同一病人同一部

11、位的活動期和靜止期內(nèi)鏡下標本共29例，對差異基因進行生物信息學分析，進一步通過Real-time PCR和免疫組織化學染色方法驗證差異基因的表達。
　　 4、統(tǒng)計學分析:用SPSS13.0軟件來進行所有的數(shù)據(jù)分析;Pearsonchi-square檢驗和Fisher's確切概率法來分析蛋白質表達與疾病病理特征之間的關系;方差分析及后續(xù)的基于方差分析的多重比較方法來分析Real-time PCR結果和基因組學差異基因結果;P＜0.

12、05被認為差異有統(tǒng)計學意義;結果的相關性用Pearson相關性檢驗，r＞0.5為強相關。
　　 結果
　　 1、用Western Blot技術驗證了與P38MAPK通路相關的差異蛋白質簇與潰瘍性結腸炎的相關性。細胞水平進一步驗證了差異蛋白簇受P38MAPK通路的調控。然后從該蛋白質簇中選取了三種可以指示P38MAPK通路活化狀態(tài)的蛋白，磷酸化P38，Galectin-3和MAWBP，免疫組化結果顯示這三種蛋白質與潰瘍性結

13、腸炎特異相關(x2=41.509，P＜0.001; x2=62.668，P＜0.001; x2=68.997，P＜0.001)，其組成的蛋白質印記以高敏感性(94.83％)和特異性(98.33％)可以對潰瘍性結腸炎進行正確判定，這種蛋白質印記是一種評估潰瘍性結腸炎炎癥程度的復合標志物。
　　 2、生物信息學分析顯示MAWBP為MAWD的結合蛋白，免疫組化和WesternBlot結果顯示MAWD同MAWBP一樣也在潰瘍性結腸炎組織

14、中表達降低。免疫共沉淀實驗顯示了兩種蛋白可以相互結合形成復合物。Real-time PCR和WesternBlot結果顯示MAWBP和MAWD真核表達載體成功轉染入Caco-2細胞。對Microarray結果進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)MAWBP和MAWD可導致ERK1通路活化，癌基因TPX2被激活高表達，而炎癥因子和趨化因子能夠被抑制。Real-timePCR驗證了炎癥因子IL8、TSC1、CXCL2和IFIT1及癌基因TPX2的表達。Mi

15、croarray和Real-time PCR結果強相關。Western Blot驗證了MAWBP和MAWD高表達能夠激活ERK通路，以及干擾RNA敲低MAWBP和MAWD的表達后能夠抑制ERK通路。
　　 3、運用DASL對潰瘍性結腸炎活動期和靜止期的基因表達譜進行分析，共發(fā)現(xiàn)上調基因909個，下調基因823個，其中上調組基因主要涉及了炎癥反應、結直腸腫瘤癌基因和EMT，下調組基因主要涉及了結直腸腫瘤抑癌基因和PPAR通路。通過

16、Real-time PCR驗證了結直腸腫瘤相關癌基因MMP1、MMP3、CHI3L1和CHRDL2，抑癌基因ABCG2和PLA2G12B在UC活動期中有顯著的差異表達，進一步通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)MMP1、CHI3L1和ABCG2在潰瘍性結腸炎、結腸癌和正常組織三組之間的表達均有統(tǒng)計學差異(x2=8.418，P=0.015; x2=6.995，P=0.030; x2=6.285，P=0.043)，提示了UC的高癌變風險。結合蛋白組學及We

17、stem Blot、Real-time PCR結果發(fā)現(xiàn)間質標志物Vimentin在UC中升高，上皮標志物E-cadherin在UC中減低。
　　 結論
　　 1、運用整合蛋白組學得到一個由三種差異蛋白組成的蛋白質印記，磷酸化P38，Galectin-3和MAWBP，是一種評估潰瘍性結腸炎炎癥程度的復合標志物。
　　 2、運用整合基因組學發(fā)現(xiàn)MAWBP及其結合蛋白MAWD可激活ERK通路、活化癌基因TPX2，并在潰