磷酸肌酸通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化對(duì)抗脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究背景和目的:磷酸肌酸(PCr)作為外源性能量物質(zhì)，可為ATP循環(huán)提供磷酸基團(tuán)，促進(jìn)細(xì)胞能量代謝。由于現(xiàn)有的研究仍對(duì)PCr是否對(duì)細(xì)胞線粒體的能量代謝及其氧化磷酸化途徑產(chǎn)生影響尚不清楚，本研究目的為探討PCr對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人靜脈細(xì)胞(HUVECs)及其細(xì)胞線粒體氧化磷酸化途徑的調(diào)節(jié)作用。
　　方法:實(shí)驗(yàn)分為5組:(1)空白對(duì)照組:正常培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞;(2) LPS組:1μg/ml的LPS作用24h;(3) PCr

2、+LPS組:分別用5mM、10mM、20mM的PCr預(yù)孵育HUVECs6h后加入1μg/ml LPS作用24h。分別使用(1) MTT法實(shí)驗(yàn)測(cè)定HUVECs細(xì)胞的生存率;(2)光鏡和電鏡分別觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化;(3)流式AV-PI雙染法測(cè)定凋亡細(xì)胞的數(shù)目;(4)流式Fluo-3法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化;(5)流式DCFH-DA熒光染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的變化;(6)流式JC-1法測(cè)定細(xì)胞線粒體膜電位的變化;(7) w

3、estern法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Caspase3、Caspase9、BCl2、Bax、Cyt C蛋白表達(dá)水平變化;(8)紫外分光光度法測(cè)定線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的活性;(9)紫外分光光度法測(cè)定線粒體呼吸控制率(RCR)、磷氧比值（P/O值）和ATP生成率的變化;(10)紫外分光光度法測(cè)定線粒體膜孔道(MPTP)的開(kāi)放程度;(11)紫外分光光度法測(cè)定細(xì)胞線粒體內(nèi)肌酸激酶(CKmt)活性的測(cè)定。
　　結(jié)果:PCr能夠在一定程度上

4、提高LPS誘導(dǎo)的HUVECs凋亡細(xì)胞的生存率，通過(guò)電鏡可以觀察到PCr可以提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，防止凋亡細(xì)胞核質(zhì)的過(guò)度邊緣化，并且可以緩解凋亡細(xì)胞線粒體的不可逆性腫脹。PCr還可以有效減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，尤其是早期凋亡細(xì)胞的數(shù)量。PCr能通過(guò)降低凋亡細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，降低凋亡細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，提高凋亡細(xì)胞的線粒體膜電位水平;減少凋亡細(xì)胞內(nèi)Caspase3，Caspase9蛋白的表達(dá)，增加線粒體抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，減少線粒體促凋亡蛋白

5、Bax的表達(dá);通過(guò)調(diào)控MPTP的過(guò)度開(kāi)放，防止線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C外溢，不同程度的提高線粒體呼吸鏈復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的活性，其中對(duì)復(fù)合酶Ⅱ活性的影響程度要大于復(fù)合酶Ⅰ。提高細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化水平（呼吸控制率、P/O比值、ATP生成率），其中PCr對(duì)以琥珀酸為底物的呼吸控制率和P/O比值的改善程度大于以蘋果酸和谷氨酸為底物的情況。并且，PCr能夠增強(qiáng)細(xì)胞線粒體內(nèi)磷酸激酶(CKmt)的活性來(lái)對(duì)抗LPS誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡。