電針預(yù)處理通過CB1R調(diào)控神經(jīng)元GluR2誘導(dǎo)腦缺血耐受作用的研究.pdf

1、腦卒中是導(dǎo)致人類死亡與殘疾最重要的病因之一,其主要的病理生理學(xué)改變是嚴(yán)重的組織缺血損傷。腦組織遭遇缺血損傷時(shí),神經(jīng)元突觸前膜會(huì)迅速釋放大量的興奮性氨基酸--谷氨酸,谷氨酸的堆積又使突觸后膜谷氨酸受體過度激活,引發(fā)嚴(yán)重的興奮毒性,造成神經(jīng)元死亡。過量的谷氨酸主要激活突觸后膜上2種谷氨酸受體:α-氨基-3羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸鹽受體(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate r

2、eceptor,AMPAR)和天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)。大量研究證實(shí)AMPAR廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),但其表達(dá)有明顯的區(qū)域性差別,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元表達(dá)最高,表明AMPAR與全腦缺血后海馬組織的特異性神經(jīng)元死亡有著更加密切的關(guān)系。AMPAR是由GluR1-GluR4四種亞基圍繞一個(gè)親水中心孔道組合而成的五聚體結(jié)構(gòu),其中GluR2決定了AMPAR的鈣離子通透性。全腦缺血損傷

3、后,GluR2蛋白表達(dá)下調(diào),使得大量鈣離子經(jīng)過通透性已改變的AMPAR進(jìn)入相對(duì)脆弱的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元,使胞內(nèi)鈣超載,引發(fā)一系列致死反應(yīng),造成神經(jīng)元死亡。許多學(xué)者曾利用AMPAR拮抗劑治療缺血性腦損傷,然而都因阻斷AMPAR過度激活的同時(shí)也破壞了AMPAR正常生理功能,均以失敗告終。然而因AMPAR GluR2亞基具有獨(dú)特的調(diào)節(jié)鈣離子通透性的作用,故該亞基可能成為針對(duì)AMPAR治療腦缺血損傷的新靶點(diǎn)。
　　有學(xué)者在爪蟾卵母細(xì)胞

4、中發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性大麻素花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA)可以直接與AMPAR作用,抑制AMPAR的亞基重組,這提示了內(nèi)源性大麻素與谷氨酸受體有著一定的關(guān)系。另有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)激活神經(jīng)元AMPAR,可引起內(nèi)源性大麻素AEA及2-花生?；视?2-arachidonoylglycerol,2-AG)合成增加,減弱興奮毒性對(duì)神經(jīng)元造成的損傷;而應(yīng)用減弱內(nèi)源性大麻素消耗的攝取抑制劑UCM707,可通過激活大麻素Ⅰ型受體(cannabi

5、noid receptor1,CB1R)與大麻素Ⅱ型受體(cannabinoid receptor2,CB2R),抵抗興奮毒性損傷。此外,有在體研究報(bào)道,紅藻氨酸誘導(dǎo)的興奮毒性使得野生型小鼠海馬組織中內(nèi)源性大麻素的含量迅速上調(diào),從而保護(hù)小鼠海馬神經(jīng)元免受興奮毒性損傷;而在CB1R基因敲除小鼠腦內(nèi),該保護(hù)作用消失。還有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),給予CB1激動(dòng)劑WIN55212-2,可以減少突觸前膜谷氨酸的釋放,而CB1R抑制劑SR141716A抵消該

6、作用,這表明內(nèi)源性大麻素可通過CB1R抑制谷氨酸能的突觸傳遞。這一系列結(jié)果說明,由AMPAR過度激活誘導(dǎo)的興奮毒性可以應(yīng)激性的使內(nèi)源性大麻素合成增加,抵抗興奮毒性,從而保護(hù)神經(jīng)元,而這一作用與CB1R關(guān)系密切。
　　我實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)在動(dòng)物百會(huì)穴給予缺血前電針預(yù)處理,可以激活內(nèi)源性大麻素系統(tǒng),上調(diào)內(nèi)源性大麻素配體AEA與2-AG,通過激活的大麻素受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但是電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。
　　

7、基于以上背景,本實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6小鼠短暫全腦缺血模型,觀察電針預(yù)處理是否通過CB1R調(diào)節(jié)GluR2,發(fā)揮缺血后腦保護(hù)作用,以求進(jìn)一步完善電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制,并且為針對(duì)AMPAR治療腦中風(fēng)帶來新的視角與契機(jī)。
　　實(shí)驗(yàn)一:電針預(yù)處理對(duì)全腦缺血損傷后海馬GluR2表達(dá)的影響
　　目的:全腦缺血損傷后,海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達(dá)下降,引起胞內(nèi)鈣超載,造成神經(jīng)元死亡。本實(shí)驗(yàn)預(yù)觀察電針預(yù)處理是否可影響全腦缺血后海馬

8、神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá)。
　　方法:
　　1.全腦缺血再灌后不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元GluR2的表達(dá)水平
　　成年雄性C57小鼠30只(18-22g),隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R),小鼠缺血再灌后2h、6h、24h、48h、72 h將動(dòng)物處死取腦,利用Western blotting,測定不同時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá)水平。
　　2.電針預(yù)處理對(duì)缺血后海馬神經(jīng)元GluR2表達(dá)的影

9、響
　　成年雄性C57小鼠20只隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、缺血組(Con)、電針(EA)預(yù)處理組(EA+GCI)、單純電針組(EA)。小鼠缺血再灌后2h處死取腦及冰凍切片,運(yùn)用Western blotting及免疫熒光染色測定海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.短暫全腦缺血再灌注后2h,海馬區(qū)GluR2表達(dá)明顯減少。
　　Western blotting顯示,與Sham組比較,I/

10、R組2h可見GluR2在海馬組織的表達(dá)明顯降低(P<0.05),其他時(shí)間點(diǎn)組間蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.電針預(yù)處理有效上調(diào)短暫性全腦缺血損傷后海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上GluR2蛋白的表達(dá)。
　　Western blotting結(jié)果顯示,與Con組比較,EA+GCI組海馬組織中GluR2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05),Sham組和EA組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果顯示,GluR2主要表達(dá)于海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞膜

11、。
　　結(jié)論:全腦缺血再灌注2h,海馬組織GluR2蛋白表達(dá)明顯降低;電針預(yù)處理可上調(diào)全腦缺血后海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二:海馬GluR2參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦保護(hù)作用的研究
　　目的:實(shí)驗(yàn)一證實(shí)電針預(yù)處理可上調(diào)缺血后海馬組織GluR2的蛋白表達(dá),但該亞基的蛋白表達(dá)變化是否影響電針預(yù)處理腦保護(hù)作用不得而知。本實(shí)驗(yàn)探索海馬組織GluR2是否參與電針預(yù)處理腦保護(hù)作用。
　　方法:
　　1.Glu

12、R2siRNA干涉海馬神經(jīng)元GluR2表達(dá)的效果驗(yàn)證
　　成年雄性 C57小鼠15只隨機(jī)分為3組:空白對(duì)照組(Sham)、siRNA干涉組(siRNA)、亂序?qū)φ战M(scRNA)。海馬定位注射后,72h后取腦,行Western blotting檢測海馬神經(jīng)元GluR2表達(dá)變化。
　　2.干涉GluR2表達(dá)對(duì)電針預(yù)處理腦保護(hù)作用的影響
　　成年雄性C57小鼠20只隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、缺血組(Con)、電針

13、處理組(EA+GCI)、GluR2干涉+電針組(siRNA+ EA+GCI)。小鼠缺血再灌后24h行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和灌注石蠟切片。評(píng)估各組小鼠神經(jīng)功能,并行TUNEL染色和Nissl染色測定海馬神經(jīng)元凋亡及存活數(shù)目。
　　3.GluR2對(duì)缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白的影響
　　成年雄性C57小鼠20只隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、缺血組(Con)、電針處理組(EA+GCI)、GluR2干涉+電針組(siRNA+EA+GC

14、I)。動(dòng)物經(jīng)歷缺血再灌注后24h處死取腦,運(yùn)用Western blotting對(duì)凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果:
　　1.干涉海馬組織GluR2蛋白表達(dá)可逆轉(zhuǎn)電針預(yù)誘導(dǎo)的腦保護(hù)作用。
　　海馬定位注射GluR2 siRNA72h后,siRNA組海馬組織中GluR2蛋白表達(dá)顯著低于Sham組與scRNA組(P<0.05),表明海馬組織GluR2的蛋白表達(dá)被抑制。
　　小鼠全腦缺血再灌后24h

15、,EA+GCI組小鼠的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分明顯優(yōu)于 Con組(P<0.05),而與EA+GCI組比較,siRNA+ EA+GCI組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分復(fù)又下降(P<0.05)。這表明抑制GluR2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理對(duì)神經(jīng)功能的改善作用。
　　小鼠全腦缺血再灌后24h,尼氏染色結(jié)果顯示,EA+GCI組的神經(jīng)元存活數(shù)目遠(yuǎn)大于Con組(P<0.05),siRNA+EA+GCI組存活神經(jīng)元數(shù)目明顯低于 EA+GCI組(P<0.05)。這表明抑制Gl

16、uR2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理抑制神經(jīng)元死亡的作用。
　　2.海馬神經(jīng)元GluR2分子通過減少缺血損傷后神經(jīng)元凋亡參與電針預(yù)處理腦保護(hù)作用。
　　小鼠全腦缺血再灌后24h,TUNEL結(jié)果顯示,與Con組比較,EA+GCI組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05),干涉掉GluR2后,缺血再灌注損傷組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量又明顯增加(P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,Con組凋亡蛋白Bax/Bcl-2比

17、例較 Sham組明顯升高,EA+GCI組該比例顯著下降(P<0.05),siRNA+ EA+GCI組則又上調(diào)該比例(P<0.05)。
　　結(jié)論:上調(diào)海馬神經(jīng)元 GluR2的表達(dá),可通過抑制缺血后神經(jīng)元凋亡,參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受作用。
　　實(shí)驗(yàn)三:內(nèi)源性大麻素2-AG預(yù)處理對(duì)腦缺血損傷后GluR2表達(dá)水平的影響
　　目的:以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)電針預(yù)處理可上調(diào)全腦缺血后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用,但電針預(yù)

18、處理通過何種機(jī)制影響GluR2的表達(dá)尚不清楚。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是電針預(yù)處理腦保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。故本實(shí)驗(yàn)欲觀察內(nèi)源性大麻素是否參與調(diào)控電針對(duì)海馬神經(jīng)元GluR2的影響。
　　方法:
　　2-AG預(yù)處理對(duì)海馬神經(jīng)元GluR2表達(dá)的影響及其可能機(jī)制
　　成年雄性C57小鼠20只隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組(Sham)、缺血組(Con)、2-AG處理組(2-AG)、2-AG+CB1受體抑制劑(AM251)組(

19、AM251+2-AG)、溶劑組(V)。小鼠缺血再灌后2h處死取腦。運(yùn)用Western blotting測定海馬神經(jīng)元GluR2的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:
　　2-AG預(yù)處理可上調(diào)缺血損傷后GluR2的表達(dá),而AM251可逆轉(zhuǎn)這一作用。
　　Western blotting顯示,與Con組比較,2-AG組GluR2在海馬組織的表達(dá)明顯升高(P<0.05);與2-AG組比較,AM251+2-AG組GluR2在海馬組織的表

20、達(dá)復(fù)又降低(P<0.05),V組和Sham組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:內(nèi)源性大麻素2-AG可上調(diào)海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá),而大麻素受體CB1R可能是其介導(dǎo)分子,故電針預(yù)處理是通過內(nèi)源性大麻素而影響GluR2的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)四:CB1R對(duì)電針預(yù)處理上調(diào)腦缺血后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達(dá)的調(diào)控作用
　　目的:前三步實(shí)驗(yàn)表明電針預(yù)處理通過內(nèi)源性大麻素影響缺血后GluR2的蛋白表達(dá),但其具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。本實(shí)

21、驗(yàn)探索電針預(yù)處理后 CB1R對(duì)缺血后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1.CB1受體激動(dòng)劑ACEA和WIN55212-2對(duì)缺血后海馬神經(jīng)元GluR2表達(dá)的影響
　　成年雄性C57小鼠25只隨機(jī)分為5組:缺血組(Con)、電針處理組(EA+GCI)、CB1受體激動(dòng)劑 ACEA組(ACEA+GCI)、CB1受體激動(dòng)劑 WIN55212-2組(WIN55212-2+GCI)、溶劑組(V+GCI)。小鼠缺血

22、再灌后2h處死取腦,行Western blotting檢測GluR2表達(dá)變化。
　　2.CB1受體拮抗劑AM251和SR141716A對(duì)缺血后海馬神經(jīng)元GluR2表達(dá)的影響
　　成年雄性C57小鼠25只隨機(jī)分為5組:缺血組(Con)、電針處理組(EA+GCI)、CB1受體拮抗劑 AM251組(AM251+EA+GCI)、CB1受體拮抗劑 SR141716A組(SR141716A+EA+GCI)、溶劑組(V+EA+GCI)。小

23、鼠缺血再灌后2h處死取腦,行Western blotting檢測GluR2表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.CB1受體激動(dòng)劑可模擬電針預(yù)處理對(duì)全腦缺血損傷后海馬神經(jīng)元GluR2分子的上調(diào)作用。
　　Western blotting結(jié)果顯示，與Con組比較，CB1受體激動(dòng)劑ACEA和WIN55212-2也可上調(diào)全腦缺血再灌后2h海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá)水平((P<0.05)。 V+GCI和Con組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。<

24、br>　　2.CB1受體拮抗劑可逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理上調(diào)全腦缺血損傷后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達(dá)的作用。
　　Western blotting結(jié)果顯示，與EA+GCI組比較，AM251+EA+GCI組和SR141716A+EA+GCI組海馬組織GluR2表達(dá)明顯下降(P<0.05)。EA+GCI和V+EA+GCI組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:電針預(yù)處理通過CB1R影響缺血后海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達(dá)。
　　總結(jié):