化濁解毒、活血通絡(luò)方對腦缺血再灌注損傷小鼠鈣超載相關(guān)機(jī)制的影響.pdf

1、目的:缺血性腦血管疾病是臨床常見病、多發(fā)病，其致死率和致殘率高，嚴(yán)重威脅人類的健康。腦缺血后的血流恢復(fù)在某些情況下能導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷和功能障礙，這種恢復(fù)血流灌注后的有害情況稱腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。抑制缺血再灌注損傷成為目前治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。國內(nèi)外研究一致認(rèn)為CIRI的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)代研究表明其發(fā)生主要與鈣超載、興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激反

2、應(yīng)、腦水腫和細(xì)胞凋亡基因被激活等有關(guān)。其中能量代謝障礙則被認(rèn)為是缺血再灌注后細(xì)胞損傷的始動(dòng)環(huán)節(jié)，代謝性毒素引發(fā)的連鎖反應(yīng)是核心環(huán)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載是導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的最后通路。由于目前臨床上用于抑制CIRI的西藥主要是干預(yù)CIRI某一環(huán)節(jié)或某一途徑的藥物，作用有限，而中醫(yī)具有整體觀和辨證論治的特點(diǎn)，以及中藥多通路多靶點(diǎn)特性，所以近年來中藥尤其是中藥復(fù)方的腦保護(hù)作用成為CIRI研究的重要內(nèi)容。臨床上導(dǎo)師常用化濁解毒、活血通絡(luò)法治療缺血性

3、腦卒中恢復(fù)期、血管性癡呆等，對神經(jīng)功能修復(fù)甚為有效，但對腦缺血再灌注損傷是否有保護(hù)作用尚缺乏實(shí)驗(yàn)研究支持。本實(shí)驗(yàn)擬觀察化濁解毒、活血通絡(luò)方對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織Ca+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性、腦組織谷氨酸(Glu)含量以及血清鈣調(diào)磷酸酯酶（CaN）含量的影響，同時(shí)觀察化濁解毒、活血通絡(luò)方對腦缺血再灌注損傷模型小鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)的影響，并深入探討化濁解毒、活血通絡(luò)方對CIRI模型小鼠鈣超載相關(guān)機(jī)制的影響，為臨床應(yīng)用提

4、供依據(jù)。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉的方法制備急性腦缺血再灌注損傷小鼠模型。健康雄性昆明小鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平對照組（文中簡稱為“尼莫地平組”），化濁解毒、活血通絡(luò)方低劑量組（文中簡稱為“低劑量組”），化濁解毒、活血通絡(luò)方高劑量組（文中簡稱為“高劑量組”）5組，每組10只(n=10)。假手術(shù)組小鼠僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，其余各組小鼠均用微型動(dòng)脈夾結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，阻斷血流，制備腦缺血再

5、灌注損傷模型。于手術(shù)后第2天開始用藥治療。假手術(shù)組和模型組均以生理鹽水灌服，尼莫地平組予尼莫地平液灌服，高劑量組和低劑量組灌服化濁解毒、活血通絡(luò)方中藥液（化濁解毒、活血通絡(luò)方由當(dāng)歸、丹參、赤芍、石營蒲、郁金、地龍、益智仁、云苓、澤瀉、川芎、黃連等中藥組成，實(shí)驗(yàn)室水煎濃縮）。各組小鼠分別于術(shù)后14d斷頭處死，取左側(cè)腦組織固定后切片，HE染色，光鏡下觀察腦組織的形態(tài)變化。取右側(cè)大腦皮層組織制成勻漿，離心后取上清液，進(jìn)行腦組織Ca2+-ATP

6、酶及Na十-K+-ATP酶活性的測定及腦組織谷氨酸(glutamic acid，Glu)含量測定。于小鼠斷頭同時(shí)取血，測定血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法采用方差分析、Dunnett'T3檢驗(yàn)。顯著性差異水平以0.05，0.01為標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1、各組小鼠腦組織海馬錐體細(xì)胞的病理形態(tài)變化:
　　

7、 光鏡下依次觀察五組小鼠腦組織海馬區(qū)的病理形態(tài)學(xué)變化，可見“假手術(shù)組”小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，層次緊密，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰:“模型組”小鼠海馬組織呈現(xiàn)缺血性病理改變，錐體細(xì)胞脫失明顯，排列紊亂，層次疏松，細(xì)胞核固縮，結(jié)構(gòu)模糊。相對而言，各用藥組小鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞病變比模型組均有所改善，以“高劑量組”改善最為顯著。
　　 2、各組小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶含量的測定結(jié)果:
　　 與假手術(shù)

8、組相比，模型組小鼠腦組織中Ca+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性明顯減弱（P＜0.01）。與模型組比較，各用藥組小鼠腦組織中Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性明顯增強(qiáng)(P＜0.01）。且高劑量組的Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性高于低劑量組及尼莫地平組(P＜0.01)，低劑量組及尼莫地平組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 3、各組小鼠腦組織谷氨酸含量的測定結(jié)果:
　　 模型

9、組小鼠腦組谷氨酸明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）;各用藥組均低于模型組(P＜0.01);用藥各組之間比較:高劑量組的谷氨酸含量低于尼莫地平組及低劑量組(P＜0.01)，低劑量組與尼莫地平組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4、各組小鼠血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量的測定結(jié)果:
　　 模型組小鼠血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01）;各用藥組均低于模型組(P＜0.01）;用藥各組

10、之間比較:高劑量組的血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量低于尼莫地平組及低劑量組(P＜0.01），低劑量組與尼莫地平組相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、采用夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制備CIRI模型小鼠，術(shù)后經(jīng)神經(jīng)病理學(xué)證實(shí)小鼠海馬錐體細(xì)胞受損，說明造模成功。
　　 2、化濁解毒、活血通絡(luò)方可改善小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，減輕海馬錐體細(xì)胞的受損程度，改善腦缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞損傷。<

11、br>　　 3、化濁解毒、活血通絡(luò)方能明顯提高CIRI模型小鼠腦組織Ca2+-ATP酶及Na+-K+-ATP酶活性，同時(shí)顯著降低谷氨酸(Glu)水平，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、腦水腫的發(fā)生，減輕興奮性氨基酸對腦的損傷，從而起到保護(hù)腦組織的作用。
　　 4、化濁解毒、活血通絡(luò)方有降低CIRI模型小鼠血清鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量的作用，可抑制鈣通道信號引起的細(xì)胞凋亡，起到減輕腦缺血再灌注損傷的作用。
　　 5、化濁解毒、活血通