利用熒光原位雜交技術(shù)研究棉花基因組的組成及進(jìn)化.pdf

1、棉花是我國乃至世界上最重要的纖維經(jīng)濟(jì)作物。棉屬包括4個栽培種和46個野生種，分屬于A、B、C、D、E、F、G、K和AD基因組。如此豐富的種質(zhì)資源為棉花的遺傳學(xué)研究提供了大量的可試材料，然而，對于明確棉花種間親緣關(guān)系及演化規(guī)律的研究，這樣數(shù)量之多的棉花種類也使研究工作變得更加復(fù)雜。此外，棉花染色體普遍存在數(shù)量大，形態(tài)小，彼此缺乏差異等特點(diǎn)，使染色體的準(zhǔn)確快速識別無法實(shí)現(xiàn)，這為開展棉花在細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究工作帶來了一定的困難。
　　

2、 熒光原位雜交(FISH)技術(shù)的誕生在很大程度上解決了上述困難。并因其具有檢出快速，靈敏度高，應(yīng)用廣泛等優(yōu)勢迅速成為分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究的一項(xiàng)重要工具。本文主要利用了FISH的衍生技術(shù)：BAC-FISH、GISH和多色GISH(McGISH)技術(shù)對栽培種亞洲棉(Gossypium arboreu)開展了分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究，同時也進(jìn)行了二倍體野生棉與異源四倍體陸地棉(Gossypium hirsutum accession(acc.))的

3、親緣關(guān)系分析。研究結(jié)果對于闡明棉花基因組組成，遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系，實(shí)現(xiàn)棉花遺傳改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。主要研究內(nèi)容如下：
　　 1.利用BAC-FISH技術(shù)進(jìn)行亞洲棉染色體核型分析：基于前期的研究結(jié)果，從江陵中棉(G.arboreum cv.JLZM)、陸地棉TM-1(G.hirsutum acc.TM-1)和恢復(fù)系0-613-2R BAC文庫中篩選了20個特異BAC克隆，這些BAC克隆在FISH雜交中不產(chǎn)生或存在很低的背

4、景干擾。再加上45s和5s rDNA，最終含有22個克隆的一套探針組合被成功開發(fā)，并將亞洲棉26條染色體同時準(zhǔn)確識別出來。依據(jù)亞洲棉與四倍體棉的同源性關(guān)系，對應(yīng)于陸地棉A亞組的命名A1-A13，亞洲棉26條染色體相應(yīng)地被指定命名為A1-A13。同時，在成功地構(gòu)建了一套可以準(zhǔn)確識別亞洲棉26條染色體的BAC克隆群的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了一個基于FISH技術(shù)的亞洲棉核型分析方法。將亞洲棉13條有絲分裂中期染色體長度按遞減的順序重新排列為：A5(包括

5、rDNA部分)，A7(包括rDNA部分)，A3，A4，A6，A1，A12，A2，A10，A8，A13，A11，和A9.BAC-FISH技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了染色體的同步識別，并充分顯示了其在棉花細(xì)胞遺傳學(xué)研究中的絕對優(yōu)勢。
　　 2.多色基因組熒光原位雜交技術(shù)體系的建立：采用陸地棉(G.hirsutum L.)標(biāo)準(zhǔn)系TM-1體細(xì)胞有絲分裂中期染色體為靶DNA，以野生種斯特提棉(G.sturtianumWillis)為探針，通過提高封阻D

6、NA與探針濃度比例、洗脫液中甲酰胺濃度、洗脫溫度、延長洗脫時間等條件，以增強(qiáng)DNA雜交反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，使靶標(biāo)中剛剛沒有雜交信號為止。結(jié)果，封阻DNA與探針之比為100:1、洗脫液中甲酰胺濃度提高至60％、洗脫溫度升高到43℃、洗脫時間延長至13min時，TM-1的靶標(biāo)染色體上無雜交信號，而以TM-1與斯特提棉雜種F1(基因組組成為AtDtC1)體細(xì)胞有絲分裂中期DNA為靶標(biāo)，則可清晰地將斯特提棉的C1基因組染色體與陸地棉基因組染色體鑒別出

7、來，建立了棉花外源染色體精準(zhǔn)鑒定的基因組原位雜交(GISH)技術(shù)體系。并在此基礎(chǔ)上，以A1基因組的阿非利加非洲棉(G.herbaceum var.africanum)和C1基因組的斯特提棉兩個棉種的DNA同時為探針，可以清晰地區(qū)分At、Dt和C1基因組染色體，且重復(fù)性好，建立了棉花多色GISH技術(shù)體系，并成功應(yīng)用于種間雜種的鑒定。對引自澳大利亞CSIRO的陸地棉與澳洲棉(G.austral F.v.M.)(基因組組成G2G2)六倍體雜種

8、(基因組組成AtAtDtDtG2G2)進(jìn)行了多色GISH雜交，可清晰地區(qū)分At、Dt和G2基因組染色體。為漸滲系中的外源DNA片段及其整合方式提供了技術(shù)支持。
　　 3.利用GISH技術(shù)研究棉花物種進(jìn)化：選擇了11個D染色體組的二倍體野生棉用于與陸地棉(G.hirsutum L)TM-1 GISH雜交以探討四倍體棉D(zhuǎn)染色體亞組供體種問題，這11個D組野生二倍體棉分別是戴維遜氏棉(G.davidsonii)、雷蒙得氏棉(G.rai

9、mondii)、瑟伯氏棉(G.thurberi)、擬似棉(G.gossypiodies)、辣根棉(G.armourianum)、三裂棉(G.trilobum)、松散棉(G.laxum)、哈克尼西棉(G.harknessii)、施沃恩蒂曼氏棉(G.schwendimanii)、裂片棉(G.lobatum)和克勞茨基棉(G.klotzschianum)。結(jié)果顯示，三裂棉的雜交信號最強(qiáng)且信號覆蓋度最大，由此推測三裂棉與陸地棉染色體亞組的同源性

10、最高，這一發(fā)現(xiàn)為陸地棉的起源與進(jìn)化的研究提供了新的證據(jù)。另一方面，分別選擇了分屬于B、C、E、F和G染色體組的異常棉(G.anomalum)、斯特提棉(G.sturtianum)、索馬里棉(G.somalense)、長萼棉(G.longicalyx)和澳洲棉(G.australe)來用于研究二倍體野生棉與陸地棉親緣關(guān)系。異常棉、斯特提棉、索馬里棉和長萼棉都與陸地棉A染色體亞組產(chǎn)生強(qiáng)烈的紅色信號，澳洲棉相對較弱。另外，斯特提棉是唯一的一個