組織型激肽釋放酶在缺氧誘導的神經元損傷中保護機制的研究.pdf

1、第一章質譜技術鑒定組織型激肽釋放酶腦相關蛋白
　　[目的]
　　為進一步闡明組織型激肽釋放酶(Tissue kallikrein,TK)的腦保護機制,采用質譜技術鑒定出TK的腦相關蛋白。
　　[方法]
　　1.分別采用兩種方法獲得差異蛋白進行質譜分析:其一,為尋找Neuro-2a細胞膜上與TK相關的蛋白,分別將包含全長、無信號肽的TK基因質粒(GFP-TK-full和GFP-TK-no)轉染至Neuro-2a細胞

2、,轉染24～36h以后,生物素標記Neuro-2a細胞膜,細胞裂解液用兔源性抗GFP抗體進行免疫共沉淀,然后用特異性識別生物素的鏈親和素-辣根過氧化物酶進行檢測;其二,將純化的TK蛋白與大鼠腦組織抽提上清液混勻作用,用兔源性抗TK抗體或IgG進行免疫共沉淀,裂解蛋白進行SDS-PAGE電泳銀染;
　　2.將上述電泳所得差異蛋白切膠酶解打質譜,并將數據進行相關處理;
　　3.RT-PCR檢測缺氧再復氧的Neuro-2a細胞中,

3、內源性差異蛋白在TK(10,100,1000 nM)處理后的表達變化,篩選出可能與TK相關的蛋白。
　　[結果]
　　1.生物素標記結果顯示:GFP-TK-full轉染組較GFP-TK-no和GFP兩轉染組出現兩條差異蛋白條帶,分子量分別為64kDa和49kDa;
　　2.TK純化蛋白與大鼠腦組織作用后結果顯示:用抗TK抗體免疫共沉淀后有一條差異蛋白,分子量約為64kDa;
　　3.質譜鑒定出19種差異蛋白;

4、r>　　4.TK濃度依賴性上調Homerlb/c和Flotillin-2的mRNA表達。
　　[結論]
　　質譜鑒定結果顯示與TK相關的腦蛋白分子量大約在40～65kDa之間。TK的作用機制很可能與Homerlb/c和Flotillin-2兩者有關,我們將把Homerlb/c作為研究TK作用機制的靶蛋白。
　　第二章組織型激肽釋放酶在缺氧誘導的Neuro-2a細胞損傷中通過Homer發(fā)揮抗凋亡作用
　　[目的]<

5、br>　　闡明TK在缺氧誘導的Neuro-2a細胞損傷中通過Homerlb/c發(fā)揮其抗凋亡作用。
　　[方法]
　　1.構建小鼠pcDNA3.1-Homerlb/c質粒,合成針對小鼠Homerlb/c特定序列的siRNA,并分別將其轉染至Neuro-2a細胞,上調及下調Homerlb/c的表達,RT-PCR和western-blot分別檢測轉染后Homerlb/c的mRNA和蛋白水平;
　　2.分別上調及下調Neuro

6、-2a細胞中Homerlb/c的表達,CCK-8方法測定細胞的存活率,LDH釋放、caspaSe-3活性及Hochcst染色檢測細胞凋亡,觀察Homerlb/c在Neuro-2a細胞缺氧損傷中的作用;
　　3.RT-PCR和western-blot分別檢測缺氧復氧后不同時間點,TK(100 nM)孵育后Homerlb/c的mRNA和蛋白表達;激光共聚焦觀察Homerlb/c在缺氧及TK作用下的表達及定位;
　　4.分別上調及

7、下調Neuro-2a細胞中Homerb/c的表達,并予細胞缺氧和TK干預,CCK-8方法測定細胞的存活率,LDH釋放、caspase-3活性及Hochcst染色檢測細胞凋亡,觀察TK的抗凋亡作用是否與Homerlb/c有關;
　　5.在上述條件下,western-blot檢測ERKl/2、P38、JNK、Akt、GSK3β的磷酸化水平,激光共聚焦觀察磷酸化的ERKl/2的表達,western-blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、B

8、ax的表達,研究TK與Homerlb/c及其下游信號通路間的關系;
　　6.過表達Homerlb/c,PD98059和LY294002分別抑制ERKl/2和P13K信號通路,CCK-8方法測定細胞的存活率,LDH釋放量檢測細胞凋亡,觀察Homerlb/c在缺氧細胞中的作用與下游信號通路間的關系。
　　[結果]
　　1.peDNA3.1-Homerlb/c和Homerlb/c siRNA轉染Neuro-2a細胞后,Hom

9、erlb/e的表達(mRNA和蛋白表達)分別明顯上調及下調;
　　2.Homerlb/c在Nero-2a細胞缺氧損傷中有抗凋亡作用:上調Homerlb/c的表達提高了細胞生存率,降低了細胞LDH釋放、caspase-3活性及Hochest染色凋亡細胞數目;而下調Homerlb/c后與上述效應相反;
　　3.TK上調Neuro-2a細胞缺氧復氧損傷中Homerlb/c的mRNA和蛋白表達,及促進Homerlb/c的膜轉位;

10、r>　　4.TK在Neuro-2a細胞缺氧損傷中通過Homerlb/c起抗凋亡作用:上調Homerlb/c,同時給予細胞缺氧和TK干預,發(fā)現細胞生存率明顯提高,細胞LDH釋放、caspase-3活性及Hochest染色凋亡細胞數目降低,提示Homerlb/c的過表達促進了TK的抗凋亡作用;相反,發(fā)現下調Homerlb/c后抑制了TK的抗凋亡作用;
　　5.TK通過Homerlb/c激活下游信號通路:在缺氧條件下,TK明顯增高了ER

11、Kl/2、Akt、GSK3β的磷酸化水平;而下調Homerlb/c后發(fā)現,TK的該促磷酸化作用明顯降低;激光共聚焦實驗顯示,上調及下調Homerlb/c后,分別提高及降低了TK的促磷酸化作用;
　　6.TK可能通過Homerlb/c促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,而抑制促凋亡蛋白Bax的表達:在缺氧條件下,TK明顯提高了Bcl-2的表達,降低了Bax的表達;而下調Homerlb/c后,TK的促Bcl-2表達的作用明顯降低,Bax的

12、表達明顯增高;
　　7.Homerlb/c通過ERKl/2和P13K信號通路起抗凋亡作用:上調Homerlb/c的表達,予細胞缺氧刺激,PD98059和LY294002均抑制了Homerlb/c過表達后的抗凋亡作用。
　　[結論]
　　在Neuro-2a細胞缺氧損傷中,TK通過上調Homerlb/c的表達激活ERKl/2和PI3K-Akt-GSK3β信號通路,而發(fā)揮其抗凋亡作用。此外,上調Homerlb/c的表達抑制了

13、缺氧誘導的細胞凋亡。
　　第三章缺氧及酸誘導Neuro-2a細胞中Homer的表達變化及其機制的研究
　　[目的]
　　探討缺氧及酸處理誘導Neuro-2a細胞中Homer的表達變化及其機制。
　　[方法]
　　1.缺氧或酸處理再灌注后不同時間點,RT-PCR和western-blot分別檢測Homerla、1b/c的mRNA和蛋白表達;持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理不同時間點,RT-PCR檢測Homerla的mRN

14、A表達,觀察缺氧或酸處理對Homer表達變化的影響;其中,在酸處理組均加入谷氨酸受體抑制劑CNQX和MK801、電壓門控鈣通道阻斷劑尼莫地平,阻斷經典鈣通道顯示ASICs的活性,以下實驗相同;
　　2.持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理不同時間點,CCK-8方法檢測細胞存活率,LDH釋放檢測細胞凋亡,觀察兩種刺激對細胞功能的影響;
　　3.持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理不同時間點,western-blot檢測ERKl/2和Akt的磷酸化水平,觀察兩

15、種刺激對細胞信號通路的影響;
　　4.給予細胞缺氧和ERKl/2抑制劑PD98059處理,RT-PCR檢測Homerla、1b/c的表達,觀察缺氧誘導的Homer的表達變化是否與ERKl/2信號通路有關;給予細胞酸、PD98059和PI3K抑制劑LY294002處理,RT-PCR檢測Homerla、1 b/c的表達,觀察酸誘導的Homer的表達變化是否與ERKl/2和PI3K-Akt信號通路有關;給予細胞酸、ASICla特異及非特

16、異抑制劑PcTX和鹽酸阿米洛利(amiloride)、鈣離子螯合劑EGTA,RT-PCR撿測Homerla、1b/c的表達,觀察酸誘導的Homer的表達變化是否與ASICla介導的Ca2+內流有關。
　　[結果]
　　1.缺氧或酸處理再灌注后均可誘導Homerla的mRNA和蛋白表達上調;持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理均在刺激后3h Homerla的表達至最高峰,且酸較缺氧處理誘導的Homerla的表達更高且持久;
　　2.持續(xù)

17、缺氧或持續(xù)酸刺激,細胞生存率逐漸降低,LDH釋放逐漸增加,且酸較缺氧處理導致細胞損傷更嚴重;
　　3.持續(xù)缺氧或持續(xù)酸刺激,細胞ERKl/2和Akt的磷酸化水平動態(tài)改變,均在刺激后30 min表達最高;
　　4.PD98059抑制了缺氧誘導的Homerla mRNA的表達上調;PD98059和LY294002分別抑制了酸誘導的Homerla mRNA的表達上調;PcTX、amiloride和EGTA分別抑制了酸誘導的Home

18、rla mRNA的表達上調。
　　[結論]
　　缺氧及酸均可誘導Neuro-2a細胞中Homerla的mRNA和蛋白表達上調。缺氧上調Homerla的mRNA表達通過ERKl/2信號通路;酸上調Homerla的mRNA表達通過ERKl/2、PI3K-Akt信號通路及ASICla介導的Ca2+內流途徑。而且,酸較缺氧處理誘導Homerla的表達更高且持久,細胞損傷更嚴重,且通過多條信號通路上調Homerla的表達,表明酸處理可