偶氮類染料及其金屬配合物與蛋白質(zhì)作用的研究及應(yīng)用.pdf

1、目的：研究偶氮類染料及其金屬配合物與蛋白質(zhì)的相互作用,優(yōu)化其作用條件,建立起幾種檢測蛋白質(zhì)的新方法,同時(shí)對偶氮染料及其金屬配合物與蛋白質(zhì)的作用機(jī)理進(jìn)行初步探討. 方法： 分別用偶氮腫Ⅲ(ArsenazoⅢ)、偶氮胂Ⅲ-鋇(Ⅱ)[ArsenazoⅢ-Ba(Ⅱ)]、偶氮氯膦Ⅰ-鐵(Ⅲ)[(2PA-Ⅰ-Fe(Ⅲ)]、磺胺偶氮氯膦(SA-CPA)幾種偶氮染料及染料.金屬配合物作為光譜探針與蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng),用分光光度法研究偶氮染料

2、-白質(zhì)、金屬配合物-蛋白質(zhì)作用的光譜行為及最適合的反應(yīng)條件(酸度、緩沖體系、表面活性劑及各種試劑的用量).通過線性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、干擾試驗(yàn)、方法對比試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)及穩(wěn)定性試驗(yàn)等對方法的線性范圍、偶然誤差、系統(tǒng)誤差、穩(wěn)定性及靈敏度等進(jìn)行評價(jià).應(yīng)用于蛋白質(zhì)樣品測定,制定血清蛋白質(zhì)檢測的參考值范圍.建立起以偶氮染料為顯色劑的蛋白質(zhì)檢測方法.并采用摩爾比法探討了染料及金屬配合物與蛋白質(zhì)作用的模型及最大結(jié)合數(shù)和結(jié)合常數(shù). 結(jié)果：

3、 1.偶氮胂Ⅲ與蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)在非離子型表面活性劑聚氧乙烯月桂醚(Bnij-35)存在下的pH2.0的Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液中,偶氮胂Ⅲ(Arse-nazoⅢ)與牛血清白蛋白(BSA)反應(yīng)生成紫紅色復(fù)合物,最大吸收波長在610nm處.表觀摩爾吸光系數(shù)為3.60×10<'5>L·mol<'-1>.cm<'-1>.線性范圍在0～56.2mg/L,回收率為96.1﹪～103.6﹪,批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)(CV

4、)分別為0.8﹪與2.0﹪,與雙縮脲法比較相關(guān)性良好,Y=0.9882X+1.1007,r=0.9898.參考值為(62.9～80.8)g/L(x±2s).將幾種試劑組合成單一試劑,所得的試劑穩(wěn)定,操作簡便快速,誤差減小,重復(fù)性好,建立起靈敏的單一偶氮胂Ⅲ試劑測定血清總蛋白的方法. 2.偶氮胂Ⅲ-鋇(Ⅱ)配合物光譜探針與蛋白質(zhì)的相互作用在表面活性劑阿拉伯樹膠(gum arobic)存在下的pH2.20Mcllvaine酸性溶液中

5、,偶氮胂Ⅲ-Ba(Ⅱ)配合物與BSA發(fā)生反應(yīng)形成三元復(fù)合物,引起吸收光譜發(fā)生紅移,最大吸收峰在611 nm處,且吸收峰明顯增高.摩爾吸光系數(shù)達(dá)<,ε611>=1.01×10<'6>L·mol<'-1>·cm<'-1>,BSA的濃度在0～67mg/L范圍內(nèi)服從比爾定律.平均回收率為104.0﹪.該法靈敏度高,選擇性好,用于實(shí)際血清樣品總蛋白的測定,與雙縮脲法相關(guān)性良好,回歸方程為Y=0.988X+1.10,r=0.9898.建立起高靈敏檢

6、測蛋白質(zhì)的方法. 3.偶氮氯膦Ⅰ-鐵(Ⅲ)配合物與蛋白質(zhì)的相互作用在pH2.80的Michaelis酸性溶液中,偶氮氯膦I(CPA-Ⅰ)與鐵(Ⅲ)及BSA形成三元復(fù)合物,最大吸收峰在570nm.該法具有較強(qiáng)的抗干擾力,彌補(bǔ)了偶氮氯膦Ⅰ測定蛋白質(zhì)干擾物質(zhì)允許量低的問題.摩爾吸光系數(shù)<,ε570nm>=2.70x10<'-5>L·mol<'-1>·cm<'-1>,線性范圍寬,可達(dá)0～82mg/L.平均回收率為100.7﹪.用于人血清

7、總蛋白的測定與雙縮脲法相關(guān)性好,回歸方程為Y=0.988X+1.10,r=0.9898.建立起抗干擾力強(qiáng)的血清蛋白質(zhì)測定方法. 4.磺胺偶氮氯膦與蛋白質(zhì)的相互作用在pH3.29的Wapole酸性緩沖溶液中,磺胺偶氮氯膦SA-CPA)與BSA發(fā)生反應(yīng),形成穩(wěn)定的復(fù)合物,最大吸收波長由560nm移至670nm處,對比度達(dá)110nm.表面活性劑平平加可增加體系的穩(wěn)定性.表觀摩爾吸光系數(shù)為2.83×10<'-5>L·tool<'-1>·

8、cm<'-1>.蛋白含量在8.2～65.4mg/L范圍內(nèi)線性良好,回歸方程為A=4.64×10<'-3>C.0.015(C為蛋白濃度,mgL),r=0.9992.平均回收率為101.3﹪.用于血清總蛋白樣品的分析與雙縮脲法相關(guān)性好,Y=0.9760X+1.8703,r=0.9844. 結(jié)論： 偶氮類染料及其金屬配合物與蛋白質(zhì)的反應(yīng)具有以下特點(diǎn): 1.靈敏度高,摩爾吸光系數(shù)達(dá)10<'5>L·mol<'-1>·Cm<

9、'-1>.金屬配合物[偶氮胂Ⅲ-鋇(Ⅱ)]測定蛋白質(zhì)較相應(yīng)的染料(偶氮胂Ⅲ)具有更高的靈敏度,摩爾吸光系數(shù)可達(dá)10<'6>L.mol<'-1>.cm<'-1>. 2.金屬配合物測定蛋白質(zhì)往往具有較強(qiáng)的抗干擾力.偶氮氯膦Ⅰ與蛋白質(zhì)反應(yīng)后,受各種離子等干擾大,給蛋白質(zhì)的分析帶來困難,偶氮氯膦Ⅰ-鐵(Ⅲ)配合物對體液中的物質(zhì)具有較大的允許量,可克服偶氮氯膦Ⅰ難于進(jìn)行血清蛋白質(zhì)測定的缺點(diǎn). 3.偶氮類染料及其金屬配合物與蛋白質(zhì)在

10、酸性條件下反應(yīng),因靜電結(jié)合作用易產(chǎn)生沉淀,故必須選擇合適的表面活性荊進(jìn)行增穩(wěn). 4.反應(yīng)速度快,室溫條件下,10分鐘內(nèi)反應(yīng)完全. 5.可用于多種蛋白質(zhì)的檢測,偶氮氯膦Ⅰ-鐵(Ⅲ)配合物和偶氮胂Ⅲ-鋇(Ⅱ)配合物除對BSA響應(yīng)外,對溶菌酶也具有較好的響應(yīng).這幾種方法均對血清總蛋白響應(yīng)良好. 6.這幾種方法用于血清總蛋白檢測與雙縮脲法相關(guān)性較好,且靈敏度較雙縮脲法高,方法簡便、快速、重復(fù)性好. 7.以磺胺偶氮