結核患者外周血骨橋蛋白水平檢測及其臨床意義.pdf

1、本課題研究目的是通過檢測結核患者外周血中骨橋蛋白(OPN)水平變化以及外周血單個核細胞(PBMC)經卡介苗感染后上清液中OPN水平動態(tài)變化，了解骨橋蛋白(OPN)的血漿濃度與結核病的活動性、病情嚴重程度的關系、療效評估及預后關系，從而闡明其在結核發(fā)病中的作用，為臨床結核的診斷及治療評估提供新的依據。 對象和方法: 1、①．診斷為結核病，并排除心、肝、腎等疾病，無免疫相關性或免疫性疾病的44例結核患者(包括浸潤性肺結核8例

2、、粟粒性肺結核3例、空洞型肺結核15例、結核性胸膜炎14例、結核性腹膜炎2例、結核性腦膜炎2例)，男28例，女16例，年齡16～76歲，平均年齡33歲。標本來自中山三院呼吸內科、消化內科及廣州市胸科醫(yī)院，均在抗結核治療前采血。其中有22例患者經抗結核治療2月后采血復查檢測指標。②．44例結核病人(治療前)、22例經抗結核治療后復查病人以及20例正常健康對照組均用一次性注射器抽取清晨空腹靜脈血4ml，分為2等份，檢測骨橋蛋白的標本使用ED

3、TA Na<,2>抗凝，待檢IL-18、IL-4的血標本置于潔凈干燥無任何添加物的試管中，常溫下靜置30min后放入離心機中2000轉/min離心20min，分離血清及血漿，置-30℃冰箱中凍存待測。③．外周血單個核細胞(PBMC)的培養(yǎng)上清液采集、培養(yǎng)及處理：以健康志愿者為對象，常規(guī)采集外周靜脈血20ml分為2份，肝素抗凝，每份加入生理鹽水10ml，混勻，注入到含淋巴細胞分層液10ml的離心管內，密度離心法(2000轉/min離心20

4、 min)，分層，收集血漿液與淋巴細胞分離液交界的PBMC。沉淀細胞沉渣加入生理鹽水10ml洗滌2次。同時沉淀細胞沉渣用RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞，調整細胞數為每孔2X10<'6>/ml，注入含10﹪胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液2ml，混勻，均勻滴入24孔培養(yǎng)板，將BCG調至2X10<'6>/ml，加入24孔培養(yǎng)板中，每份分為3孔，測定后取均值。根據預實驗并參考文獻確定培養(yǎng)時間為3d。放入37℃的5﹪CO<,2>培養(yǎng)箱溫育培養(yǎng)7

5、2小時(分別于12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時)提取培養(yǎng)上清液200μl，提取培養(yǎng)上清液200μl，-30℃冰箱凍存，待測OPN、IL-18、IL-4水平。 2、根據臨床癥狀、體征、胸片、實驗室檢查結果將44例結核患者分別分為重癥結核組(包括粟粒性肺結核和空洞性肺結核)與普通結核組(包括結核性胸膜炎)、痰菌陽性組(包括痰涂片陽性或痰培養(yǎng)陽性)與痰菌陰性組(包括痰涂片陰性或痰培養(yǎng)陰性)、發(fā)熱組(腋溫>37

6、.5℃超過3天，并排除中樞神經疾病、甲狀腺功能亢進、皮膚病等疾病)以及無發(fā)熱組(除去發(fā)熱組以外的其他病人)、ESR升高組(男性>15mm/h，女性>20mm/h)與ESR正常組(男性≤15mm/h，女性≤20mm/h)，另外，根據世界衛(wèi)生組織和國際防癆和肺病聯合會規(guī)定的結核菌素純蛋白衍化物(purified proteinderivative，PPD)皮試判定結果判定標準：硬結直徑≤4mm為陰性(-)，硬結直徑5mm～9mm為弱陽性(+

7、)，硬結直徑10mm～19mm為陽性(++)，硬結直徑≥20mm或雖局部硬結<20mm但出現水泡和淋巴管炎為強陽性反應。將重癥結核組與普通結核組、痰菌陽性組與痰菌陰性組、發(fā)熱組與無發(fā)熱組、ESR升高組與ESR正常組、PPD皮試≥(++)組與PPD皮試≤(+)組分別進行OPN、IL-18、IL-4檢測分析。 3、正常健康對照組20人，男14名，女6名，年齡21～55歲，平均年齡23歲，全部來自本院健康師生志愿者及門診健康體檢者。

8、 4、結核患者、正常健康對照組外周血OPN、IL-18、IL-4及外周血單個核細胞(PBMC)經BCG刺激后提取的培養(yǎng)上清液中OPN、IL-18、IL-4測定用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，按試劑盒(OPN產品編號EK0482，IL-4產品編號EK0404，武漢博士德公司分裝，廣州威佳公司代理)，IL-18(RapidBioLab公司產品，廣州威佳公司代理，批號：12150522)，均按說明書要求操作。 5、統計學處理

9、：采用t檢驗或配對t檢驗，數據以均數±標準差(x±SD)表示，應用SPSS11.0統計分析軟件包進行Independent sample t檢驗分析。兩因素相關分析用直線相關分析。所有數據輸入計算機，對治療前后組血漿OPN水平進行配對樣本t檢驗，余各組外周血中OPN、IL-18、IL-4水平進行獨立樣本t檢驗。P<0.05被認為有統計學差異。 結果: 1、結核患者外周血中OPN和IL-18(OPN與IL-18分別為160

10、.54±32.42 ng/ml、180.23±46.92pg/ml)較對照組(OPN與IL-18分別為64.09±21.17ng/ml、86.81±35.62 pg/ml)明顯升高。嚴重肺結核(空洞型、粟粒性肺結核)的IL-4水平(40.06±19.98pg/ml)較普通結核組(27.31±10.55pg/ml)明顯升高。 2、經抗結核治療后患者臨床癥狀均緩解，胸片提示病灶吸收好轉或胸腔積液消失，并對22例結核患者進行了抗結核治

11、療前后OPN與IL-18、IL-4水平對比，治療后OPN與IL-18水平(OPN與IL-18分別為76.18±20.69ng/ml和98.07±31.56pg/ml)較治療前(OPN與IL-18分別為152.33±30.19 ng/ml和163.94±38.22pg/ml)明顯降低。IL-4水平則是結核發(fā)病早期病人中明顯低(35.79±13.82pg/ml)，恢復期及治療后水平上升(63.11±20.96 pg/ml)。 3、結

12、核患者的臨床資料：44例結核患者(包括浸潤性肺結核8例、粟粒性肺結核3例、空洞型肺結核15例、結核性胸膜炎14例、結核性腹膜炎2例、結核性腦膜炎2例)，男28例，女16例，年齡16～76歲，平均年齡33歲。44例結核患者中，25例發(fā)熱，空洞性肺結核15例，痰菌陽性15例，胸腔積液14例，PPD皮試≥(++)22例。經抗結核治療后患者臨床癥狀均緩解，胸片提示病灶吸收好轉或胸腔積液消失，并對22例結核患者進行治療前后OPN、IL-18、IL

13、-4水平對比。 4、①.結核患者中重癥結核組(包括粟粒性肺結核和空洞性肺結核)血漿骨橋蛋白水平(173.62±31.19 ng/ml)明顯高于普通結核組的血漿骨橋蛋白水平(112.68±26.03 ng/ml)，二者有顯著差異(P<0.05)；②.結核患者中痰菌陽性組血漿骨橋蛋白水平(159.35±24.77ng/ml)明顯高于痰菌陰性組的血漿骨橋蛋白水平(98.80±30.5lng/ml)，二者有顯著差異(P<0.05)；③.

14、結核患者中臨床癥狀有發(fā)熱組的血漿骨橋蛋白水平(131.18±20.97 ng/ml)與無發(fā)熱組的血漿骨橋蛋白水平(117.62±25.22ng/ml)二者無顯著差異(P>0.05)；④.結核患者中PPD皮試≥(++)組的血漿骨橋蛋白水平(179.38±27.07ng/ml)明顯高于PPD皮試≤(+)組血漿骨橋蛋白水平(97.66±23.62 ng/ml)，二者有顯著差異(P<0.05)；⑤.結核患者中ESR升高組的血漿骨橋蛋白水平和ES

15、R正常組的血漿骨橋蛋白水平二者無顯著差異(P>0.05)。 5、外周血單個核細胞(PBMC)經卡介苗(BCG)刺激后提取培養(yǎng)上清液OPN在48小時達到最高水平(30.69ng/ml)，IL-18在60小時達到最高水平(59.17pg/ml)，IL-4水平則呈逐漸降低趨勢。 結論: 1、骨橋蛋白、IL-18、IL-4與結核病發(fā)病有明顯相關性。結核病患者血漿中骨橋蛋白、IL-18水平明顯高于健康對照組，IL-4水平則

16、是結核發(fā)病早期病人中明顯低，恢復期及治療后水平上升；治療前結核患者血漿骨橋蛋白濃度水平與血清IL-18的水平呈正相關性。 2、血漿骨橋蛋白水平和結核病人的臨床癥狀、病情嚴重程度有密切的相關性，空洞、痰菌陽性組骨橋蛋白水平明顯高于無空洞、痰菌陰性組，且治療好轉后結核患者血漿骨橋蛋白水平較治療前血漿骨橋蛋白水平顯著下降。 3、外周血單個核細胞(PBMC)經卡介苗(BCG)刺激后提取培養(yǎng)上清液OPN、IL-18水平呈明顯升高趨