卵形鯧鲹TLR7亞家族及其信號(hào)通路相關(guān)基因的克隆與免疫應(yīng)答分析.pdf

1、TLR7亞家族由TLR7、TLR8和TLR9組成，分布于細(xì)胞內(nèi)涵體，為I型跨膜蛋白，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)LRRs負(fù)責(zé)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域可募集接頭分子MyD88或TRIF，激活I(lǐng)RAK-4，活化IRF和NF-κB，誘導(dǎo)表達(dá)IFNs和促炎性細(xì)胞因子，從而啟動(dòng)先天性免疫和獲得性免疫，抵御病原入侵。
　　卵形鯧鲹是我國(guó)南方地區(qū)一種重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類，鱸形目鲹科的一種。近年來(lái)，隨著高密度養(yǎng)殖

2、的發(fā)展，由細(xì)菌或病毒感染引起的相關(guān)疾病頻繁發(fā)生，導(dǎo)致魚(yú)類大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開(kāi)展卵形鯧鲹免疫相關(guān)分子的克隆與免疫應(yīng)答研究，具有重要的理論與現(xiàn)實(shí)意義。本研究克隆了卵形鯧鲹TLR7亞家族及其信號(hào)通路相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，采用qPCR檢測(cè)上述各基因在健康魚(yú)體組織中的表達(dá)，并分析用溶藻弧菌和PolyI:C刺激后上述基因在脾臟和頭腎組織中的表達(dá)變化。主要研究結(jié)果如下:
　　

3、1、卵形鯧鲹TLR7(TrTLR7)、TrTLR8和TrTLR9全長(zhǎng)cDNA分別為4185bp、3432bp和3756bp，5'UTR分別為99bp、93bp和66bp;3' UTR分別為945bp、267bp和519bp; ORF分別為3141bp、3072bp和3171bp，分別編碼1046、1023和1056個(gè)氨基酸殘基。預(yù)測(cè)蛋白序列均存在胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)分別存在16、15和17個(gè)LRRs;胞內(nèi)區(qū)均具有1個(gè)保守的

4、TIR結(jié)構(gòu)域。TrTLR7、TrTLR8和TrTLR9均與其它魚(yú)類相應(yīng)的蛋白同源性較高，分別為66.2％-80.4％、53.3％-76.3％和53.2％-77.6％。在NJ法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)上TrTLR7、TrTLR8和TrTLR9分別與其它魚(yú)類聚為一支，表明它們的遺傳關(guān)系親近。
　　2、TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7全長(zhǎng)cDNA分別為1213bp、1606bp、1611bp和2083bp;5' UTR分別

5、為63bp、62bp、64bp和69bp;3'UTR分別為283bp、134bp、104bp和691bp; ORF分別為867bp、1410bp、1431bp和1323bp，分別編碼288、469、476和440個(gè)氨基酸殘基。TrMyD88存在DD和TIR結(jié)構(gòu)域;TrIRAK4具有DD和S-TKc結(jié)構(gòu)域;TrIRF3和TrIRF7均具有IRF結(jié)構(gòu)域和IRF-3結(jié)構(gòu)域。TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7均與其它魚(yú)類

6、相應(yīng)的蛋白同源性較高，同源性分別為69.6％-84.7％、49.5％-77.3％、42.8％-82.4％和52.0％-81.7％，在NJ法構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)上TrMyD88、TrIRAK4、TrIRF3和TrIRF7分別與其它魚(yú)類聚為一支，表明它們的遺傳關(guān)系親近。
　　3、qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，TrTLR7亞家族及其信號(hào)通路相關(guān)基因在健康魚(yú)體組織中呈組成型表達(dá)。TrTLR7亞家族各成員在脾臟中表達(dá)最高，其次為鰓和腎臟等組織，TrTLR7

7、和TrTLR8在腸中表達(dá)量最低，TrTLR9在肌肉中的表達(dá)量最低;TrMyD88在脾臟中表達(dá)最高，其次為肝臟和鰓等組織，肌肉中表達(dá)量最低;TrIRAK4在皮膚中表達(dá)量最高，其次為脾臟、和肝臟等組織，腸組織中表達(dá)量最低;TrIRF3和TrIRF7均在脾臟和肝臟等組織中表達(dá)較高，腸組織中表達(dá)量最低。
　　4、卵形鯧鲹經(jīng)溶藻弧菌刺激后，TrTLR7、TrTLR8、TrIRF3和TrIRF7的mRNA在頭腎和脾臟中的表達(dá)上調(diào)，但不顯著;T