HER2靶向性重組tBid分子對骨肉瘤SOSP-9607細胞的促凋亡作用.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma) 是兒童和青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤。20世紀70年代以前，主要治療方法是截肢和關節(jié)離斷，從外科治療到出現肺轉移的平均時間為8個月，5年生存率<25％。隨著外科技術和影像學的發(fā)展，新輔助化療和免疫治療的進步，骨肉瘤治愈率有了明顯改進，5年生存率達到80％。但目前的治療手段仍無法解決腫瘤病人的轉移、復發(fā)和藥物耐藥等情況，腫瘤的基因靶向性分子治療的出現為骨肉瘤的治療開辟了一條新的治療途徑。 Bi

2、d（BH3-interacting domain death agonist）是一種僅含有BH3結構域的Bcl-2家族成員蛋白，全長為195aa，分子量為22kDa。Bid位于細胞漿內，在死亡受體介導的細胞凋亡信號途徑中, 可引起Caspase-8聚集活化,活化的Caspase-8切割Bid，去除N末端片段，形成活性的截短的Bid ( truncated Bid，tBid)分子。tBid的分子量為15kDa，從細胞漿轉位到線粒體中，通過

3、調節(jié)細胞色素c（Cyt c）釋放和其他線粒體凋亡分子調節(jié)凋亡過程。 HER2/neu分子是癌基因erbB2的編碼產物，其編碼基因定位于人染色體17q21，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，是表皮生長因子（EGF）受體家族的成員之一。通常情況下，HER2/neu只在胎兒時期表達，到成年以后，僅有低水平表達于細胞表面。HER2/neu的過度表達存在于多種腫瘤組織，如轉移性乳腺癌（25％-30％）、炎癥性乳腺癌（50％）、轉移性導管

4、癌（60-70％）、非小細胞肺癌（13-55％）、卵巢癌（18-43％）、子宮內膜癌（10-52％）、直腸結腸癌（33-85％）、腎癌（22-36％）、頭頸癌（16-50％）、胃癌（21-64％）、食道癌（10-26％）、前列腺癌（5-46％）等。另40-44％成骨肉瘤及58％成骨肉瘤肺轉移等，成為一種公認的腫瘤標志物。 本研究將信號肽、單鏈抗體、來源于綠膿桿菌的具有膜轉位作用的肽段和tBid融合，構建分泌型靶向促凋亡分子Imm

5、uno-tBid（pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)-tBid61，即pCMV-5-2），使其能特異性識別、內化并轉位進入細胞液中，誘導HER2陽性的腫瘤細胞凋亡。 首先采用脂質體轉染法將tBid基因轉染骨肉瘤細胞系SOSP-9607，通過間接免疫熒光法、流式細胞儀及電鏡等方法，對tBid的促調亡活性進行了檢測。實驗結果顯示tBid在骨肉瘤細胞中能夠有效得到表達，轉染pcDNA3空載體的對照組細胞形態(tài)正常，細胞膜完

6、整，而轉染pcDAN3-tBid61的實驗組細胞則變得較少，形態(tài)發(fā)生改變，體積變小并且固縮。對轉染細胞進行電鏡觀察，發(fā)現細胞膜出胞，胞核濃縮，染色質聚集等凋亡特征。使用流式細胞儀、Annexin V和PI雙染，監(jiān)測細胞膜表面磷脂酰絲氨酸外翻情況，結果表明，與對照組細胞（6％）相比，實驗組早期調亡和凋亡繼發(fā)死亡率為35.8％。 進一步采用脂質體轉染法將重組的活性tBid 融合蛋白基因（pCMV-5-2）轉染HER2陽性骨肉瘤SOS

7、P-9607細胞，觀察其對骨肉瘤SOSP-9607細胞的凋亡誘導作用。通過間接免疫熒光的方法從細胞形態(tài)學的變化來檢測凋亡，觀察到轉染目的基因后有細胞固縮、核濃縮等凋亡特征。進一步通過Annexin V染色、流式細胞儀檢測，與對照組細胞（6％）相比，凋亡率為42％，表明細胞膜表面有磷脂酰絲氨酸外翻，說明重組Immuno-tBid基因表達后有促凋亡作用。 將pCMV-5-2基因用脂質體包裹，肌肉注射荷有HER2陽性骨肉瘤（SOSP-

8、9607）的裸鼠，可觀察到治療組瘤體生長速度慢于對照組。免疫組織化學結果顯示，Immuno-tBid蛋白選擇性地分布于治療組裸鼠的腫瘤組織和肌肉組織中，其他組織如心、肝、脾、肺、腎臟中，以及在對照組腫瘤組織中，染色呈陰性或弱陽性，后者可能是內源性Bid表達的結果。進一步對腫瘤組織進行TUNEL染色，可檢測到治療組的腫瘤細胞呈現TUNEL陽性。以上結果表明Immuno-tBid選擇性地分布于HER2陽性的腫瘤組織中，并通過引起腫瘤細胞凋亡