柑桔無核機理及無核性狀分子標記研究.pdf

1、無核作為一個重要的園藝性狀，在長期的生產(chǎn)實踐中被選擇保留下來；無核果實以其食用方便、品質(zhì)優(yōu)良而倍受人們的青睞，其無論在鮮食和加工上都具有重要意義。上世紀60年代以來，國外已逐步將鮮食品種無核化，當今國際柑桔市場上的名牌品種都是無核或少核的；我國柑桔品種資源十分豐富，地方良種很多，但栽培的品種多是有核甚至多核的，因而影響了商品價值和在國際市場上的競爭力。因此，培育無核或少核品種是柑桔育種的重要目標，研究柑桔無核的內(nèi)在成因，有著極其重要的意

2、義。目前對柑桔無核機理的研究多集中在形態(tài)學(xué)和解剖生理等方面，而利用分子生物學(xué)的手段進行基因水平上的研究開展的工作還較少，對柑桔無核的分子機制缺乏相應(yīng)的了解。 本研究以無核椪柑新品種‘麗椪2號’為材料，以麗水當?shù)仄胀ㄓ泻藯崭虨閷φ眨瑥男叟渥芋w育性、雌配子體育性和自交親和性等方面方面系統(tǒng)查明‘麗椪2號’椪柑的無核成因；為了尋找與柑桔無核基因相連鎖的分子標記，分別以8個椪柑品種和4個本地早桔株系為材料，采用AFLP分析的方法，來分離椪

3、柑無核品種和本地早無核變異株系的特異AFLP標記片段，并比較了這些片段序列與已知功能基因的同源性，以期對以后柑桔無核基因的精細定位和全基因克隆做一些初步的探索。本試驗主要研究結(jié)果如下： 1.‘麗椪2號’的無核成因1.1 ‘麗椪2號’花粉低育?；ㄋ幓ǚ哿?shù)量、花粉萌發(fā)能力和花粉染色活力都顯著低于有核品種?！悧?號’椪柑和有核對照每?；ㄋ幍钠骄ǚ哿?shù)量分別為25300和41500個，二者的差異達到了顯著水平；在篩選出的最佳蔗糖濃

4、度培養(yǎng)基(1％瓊脂+20％蔗糖+0.01％硼酸)上，‘麗椏2號’和有核對照花粉發(fā)芽率兩年的測定結(jié)果分別為1.18％和15.05％，0.82％和14.35％；花粉染色活力兩年的測定結(jié)果分別為9.27％和50.23％，9.18％和45.07％。 1.2 掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)兩品種花粉粒在微觀結(jié)構(gòu)方面存在很大的差異。有核花粉為長球形或近長球形，飽滿，外壁網(wǎng)眼大，有4～5條萌發(fā)溝明顯可見，萌發(fā)溝淺，溝界極區(qū)大；‘麗椪2號’花粉表現(xiàn)為畸形的凹

5、癟狀或棗核狀，多處條狀凹陷，外壁網(wǎng)眼小，呈陷點狀，萌發(fā)溝有4～5條，但為窄帶狀，溝腹較深，溝界極區(qū)小，萌發(fā)孔內(nèi)陷。 1.3 ‘麗椪2號’花粉母細胞減數(shù)分裂存在異常。通過花粉母細胞減數(shù)分裂期染色體行為觀察發(fā)現(xiàn)，‘麗椪2號’的花粉母細胞有分裂異常的情況出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為分裂前期Ⅰ出現(xiàn)染色體鏈和染色體環(huán)，后期Ⅰ在有些母細胞中還出現(xiàn)不均等分裂和落后染色體現(xiàn)象。其中染色體鏈比例高達37％，組成鏈的染色體個數(shù)從3～9個不等，染色體環(huán)的比例約為

6、8％，最典型的是細胞中出現(xiàn)了染色體鏈上套有染色體環(huán)。這些染色體異常都會導(dǎo)致‘麗椪2號’的花粉畸形，進而造成花粉低育。 1.4‘麗椪2號’胚囊敗育石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，有核對照到受精后第7天可見胚囊內(nèi)受精卵已經(jīng)進行有絲分裂發(fā)育成球形胚，而‘麗椪2號’在胚囊發(fā)育過程中，在花后第2天觀察到胚囊二核期，花后4～5天的胚珠中觀察到了胚囊四核期，但是在其后的連續(xù)切片中未發(fā)現(xiàn)有八核期的胚囊，‘麗椪2號’胚囊敗育的時期從四核期開始，隨著發(fā)育進程，‘

7、麗椪2號’胚囊中空，其形狀由長形逐漸變?yōu)閳A形，圓形空腔逐漸增大，到花后第11～12天在珠心中出現(xiàn)明顯的球形空腔。 1.5雜交試驗‘麗椪2號’無論是自花授粉還是授以高育性的雪柑花粉，在授粉后17天和96天的座果率差異都不顯著，說明其無核性狀不是由自交不親和造成的；雜交‘麗椪2號’最終得到65個果實中只得到1粒種子，幾乎全為無核果，證明‘麗椪2號’的無核性狀是由雌性器官敗育引起的。但是通過授粉能夠促進子房的發(fā)育，使其座果。

8、2.柑桔無核性狀的分子標記研究2.1采用AFLP和DNA分池技術(shù)相結(jié)合的方法，分析了8個有代表性的椪柑品種，72對引物組合中有13個引物組合初步篩選到19個多態(tài)性片段，將這些差異片段進一步在8個個體中驗證，共得到5個無核基因連鎖標記AFLP-1、AFLP-2、AFLP-3、AFLP-4和AFLP-5；片段大小從128bp到267bp不等，所有序列提交Genebank核酸序列數(shù)據(jù)庫，Blast結(jié)果顯示，標記AFLP-1與擬南芥種子發(fā)育缺陷

9、突變體(titan)TTN基因家族成員ttn8基因和染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(SMC1)編碼基因片段都有73％的一致性；AFLP-2與擬南芥一種GTP酶激活蛋白(GTPase-Activating Protein，GAP)編碼基因部分序列的一致性為80％；AFLP-3與擬南芥ATP依賴性膜轉(zhuǎn)運蛋白家族成員PGP18編碼基因和ATP結(jié)合運輸?shù)鞍拙幋a基因片段分別有71％和69％的一致性；AFLP-4與梨屬植物ATP合成酶基因和鐵氧還蛋白谷氨酸合成

10、酶基因比對區(qū)域的一致性同為83％；AFLP-5片段序列與擬南芥糖基水解酶家族蛋白17編碼基因和beta-1.3-葡聚糖酶相關(guān)蛋白編碼基因序列片段也都有73％的一致性。這些結(jié)果表明，分離得到的5個特異標記片段與上述功能基因都有一定的同源性。 2.2采用相同的引物組合和方法對來自浙江黃巖的4個本地早桔株系(3個無核變異株系，1個有核株系)進行分析，72對引物組合中篩選出12對多態(tài)性較好的引物進行最終擴增；得到了9條清晰穩(wěn)定的特異片斷