貝伐單抗對(duì)大鼠結(jié)膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及濾過術(shù)后瘢痕化的影響.pdf

1、[目的]：
　　 1、檢測(cè)S-D大鼠結(jié)膜成纖維細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)及其受體，以及炎癥因子的mRNA表達(dá)情況。
　　 2、研究貝伐單抗（anti-VEGFA,Avastin）對(duì)大鼠結(jié)膜成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響，以及對(duì)結(jié)膜成纖維細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、炎癥因子表達(dá)的影響。
　　 3、評(píng)價(jià)貝伐單抗對(duì)大鼠濾過泡形態(tài)學(xué)影響以及濾過泡內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)

2、因子、炎癥因子的影響。
　　 [方法]：
　　 1．結(jié)膜成纖維細(xì)胞(Fibroblasts，F(xiàn)Bs)培養(yǎng)及鑒定：以5只出生后4周的S-D大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，剪取結(jié)膜下組織，應(yīng)用組織塊法接種于培養(yǎng)基并培養(yǎng)。觀察FBs生長(zhǎng)。傳代至第5代后，將培養(yǎng)的S-D大鼠的FBs分別接種于96孔板，分別在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、120小時(shí)、7天、14天共六個(gè)時(shí)點(diǎn)，用MTT法測(cè)量細(xì)胞密度并繪制S-D大鼠FBs的正常生長(zhǎng)曲線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的

3、培養(yǎng)的第四和第五代FBs，以間接免疫熒光法鑒定。陽性對(duì)照為波形蛋白熒光染色(Vimentin-FITC)，陰性對(duì)照為角蛋白熒光染色(Keratin-FITC)。
　　 2．FBs中生長(zhǎng)因子和受體的表達(dá)：取第四代和第五代培養(yǎng)的S-D大鼠的FBs，以間接免疫熒光法鑒定VEGFR1的熒光表達(dá)。根據(jù)Primerblast程序及參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)VEGF164，VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(Flk1)，TGFβ1和TGFβ2五種基因

4、的RNA引物序列。以Trizol法提取FBs中的mRNA，在RNA反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成cDNA，以25μl體系行PCR擴(kuò)增。配制2％瓊脂糖凝膠并跑膠。對(duì)目的條帶切膠純化后進(jìn)行基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBIPrimerBlast比對(duì)，以驗(yàn)證擴(kuò)增的片斷是否屬于目的基因序列。
　　 3．貝伐單抗對(duì)培養(yǎng)的結(jié)膜FBs生長(zhǎng)的影響：以離體培養(yǎng)的大鼠第五代結(jié)膜FBs為對(duì)象，在96孔板中加入不同濃度的貝伐單抗干預(yù)FBs生長(zhǎng)。貝伐單抗的終濃度分別為

5、12.5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.5mg/ml、0.05mg/ml、0.005mg/ml，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。觀察時(shí)點(diǎn)為第1天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天。分別以MTT法檢測(cè)FBs生長(zhǎng)狀況，繪制不同濃度貝伐單抗干預(yù)下FBs的生長(zhǎng)曲線。以2.5mg/ml（最適干預(yù)濃度）的貝伐單抗干預(yù)6孔板培養(yǎng)的第六代FBs細(xì)胞，提取培養(yǎng)48小時(shí)FBs細(xì)胞的mRNA。通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用ABI7500熒光定量PC

6、R反應(yīng)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行檢驗(yàn)及熔解曲線對(duì)擴(kuò)增特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)VEGF164，VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(Flk1)，TGFβ1，TGFβ2行熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線及ddCt值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，檢測(cè)五種基因的mRNA表達(dá)豐度變化。
　　 4．貝伐單抗對(duì)大鼠眼外濾過術(shù)后濾過泡形態(tài)的影響：以55只出生后4周的S-D大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，進(jìn)行分組。5只大鼠的單眼用于眼外濾過手術(shù)模型的建立。干預(yù)

7、研究分為A1組、A2組和B組。A1組（貝伐單抗干預(yù)組）：共25只眼(25只大鼠)，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（共5個(gè)時(shí)點(diǎn)），選5只大鼠的一只眼行眼外濾過聯(lián)合貝伐單抗結(jié)膜下注射（5眼/時(shí)點(diǎn)×5個(gè)時(shí)點(diǎn)）；A2組（另眼對(duì)照組）：共25只眼（與A1組為同一組大鼠），在與A1組相同的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，選5只大鼠的另只眼行濾過手術(shù)聯(lián)合PBS結(jié)膜下注射（5眼/時(shí)點(diǎn)×5個(gè)時(shí)點(diǎn)）；B組（單獨(dú)對(duì)照組）：共25只眼（25只大鼠），在與A1組相同的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，選5只大鼠的一只眼行

8、濾過手術(shù)聯(lián)合PBS結(jié)膜下注射（5眼/時(shí)點(diǎn)×5個(gè)時(shí)點(diǎn)）。首先對(duì)5只大鼠進(jìn)行眼外濾過手術(shù)，以上方角膜緣為基底，制作大鼠眼外濾過手術(shù)模型并建立標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)步驟。連續(xù)觀察術(shù)后濾過泡形態(tài)及前節(jié)變化至第14天，記錄形態(tài)學(xué)改變及不良事件。對(duì)50只大鼠施行眼外濾過聯(lián)合結(jié)膜下注藥術(shù)。干預(yù)方法為盲法隨機(jī)注射貝伐單抗或PBS緩沖液3μl于下方穹隆結(jié)膜。觀察時(shí)點(diǎn)為第1天、第2天、第3天、第5天、第8天（根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及濾過泡術(shù)后形態(tài)變化設(shè)定）。觀察項(xiàng)目為：濾過

9、泡形態(tài)（0～3級(jí)）；濾過泡充血（0～3級(jí)）；不良事件，包括前房出血(0～3級(jí))、虹膜變化（0～3級(jí)）和其它不良反應(yīng)。根據(jù)觀察記錄進(jìn)行Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較：采用秩變換，以秩次代替原變量進(jìn)行方差參數(shù)分析。
　　 5．貝伐單抗對(duì)大鼠濾過泡中生長(zhǎng)因子和受體表達(dá)的影響：選擇在第五部分接受眼外濾過聯(lián)合結(jié)膜下注藥術(shù)的三組S-D大鼠。分別在第1天、第2天、第3天、第5天、第8天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死剪取濾過泡

10、組織，并即刻液氮冷凍保存。在統(tǒng)一時(shí)間以Trizol法提取mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)ABI7500熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)目的基因包括：VEGF164，VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(Flk1)、TGFβ1、TGFβ2及內(nèi)參照β-actin。結(jié)果采用One-WayANOVA檢驗(yàn)，比較在不同時(shí)間點(diǎn)，三組樣本中各基因的RNA表達(dá)差異。各時(shí)點(diǎn)采集的濾過泡標(biāo)本以Trizol法提取mRNA的同時(shí)提取組織總蛋白，采用Western-b

11、lotting法檢測(cè)在不同時(shí)間點(diǎn)的三組樣本中，VEGFA、TGFB1和TGFβ2蛋白表達(dá)情況的差異。
　　 [結(jié)果]：
　　 1．體外培養(yǎng)S-D大鼠結(jié)膜FBs的形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)曲線：S-D大鼠的結(jié)膜囊組織塊在接種6小時(shí)內(nèi)大部分貼壁。第3天可見FBs自組織塊邊緣長(zhǎng)出，經(jīng)1∶1傳代后，約7天可達(dá)80%融合。大鼠結(jié)膜組織培養(yǎng)后的FBs細(xì)胞較短，可見分枝狀、多角形及不規(guī)則形細(xì)胞。MTT法檢測(cè)顯示，F(xiàn)Bs的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為第2～7天，

12、第8天后進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 2．培養(yǎng)大鼠結(jié)膜FBs的免疫熒光鑒定結(jié)果：間接免疫熒光法染色可見S-D大鼠結(jié)膜FBs波形蛋白熒光染色陽性，角蛋白熒光染色陰性。
　　 3．培養(yǎng)大鼠結(jié)膜FBs中生長(zhǎng)因子和受體的表達(dá)：間接免疫熒光法染色見細(xì)胞膜上VEGFR1呈弱陽性表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果均符合目的基因序列(VEGF164、Flt-1、Flk1、TGFβ1和TGFβ2)。引物經(jīng)擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)，證實(shí)擴(kuò)增效率一致。
　　 4．貝

13、伐單抗對(duì)培養(yǎng)結(jié)膜FBs生長(zhǎng)曲線影響：對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FBs按照不同濃度梯度進(jìn)行貝伐單抗干預(yù)后顯示，終濃度為2.5mg/ml的貝伐單抗對(duì)FBs生長(zhǎng)具有更顯著的抑制作用。終濃度為12.5mg/ml的貝伐單抗干預(yù)后，F(xiàn)Bs在24小時(shí)內(nèi)死亡。
　　 5．貝伐單抗(2.5mg/ml)干預(yù)培養(yǎng)結(jié)膜FBs的熒光定量PCR結(jié)果：(1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠結(jié)膜FBs中，VEGF164、VEGFR1、VEGFR2、TGFβ2mRNA表達(dá)均顯著增加，而

14、TGFβ1mRNA表達(dá)變化不明顯且不受貝伐單抗影響。(2)2.5mg/ml貝伐單抗干預(yù)后48小時(shí)，各細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)豐度均較對(duì)照組顯著降低，其中以VEGF164(45%)和TGFβ2(25%)抑制更為顯著。
　　 6．S-D大鼠眼外濾過術(shù)后的濾過泡形態(tài)：接受濾過手術(shù)后，濾過泡在術(shù)后4天內(nèi)保持彌散隆起形態(tài)，第6天濾過泡開始平伏。
　　 7．濾過術(shù)聯(lián)合貝伐單抗結(jié)膜下注射后對(duì)濾過泡的影響及不良事件：貝伐單抗干預(yù)組（A1組

15、）出現(xiàn)濾過泡平伏的例數(shù)為0例（發(fā)生例數(shù)少于兩對(duì)照組）,3級(jí)濾過泡例數(shù)多于兩對(duì)照組，經(jīng)Kruskal-WallisH檢驗(yàn)顯示三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.032)；A1組濾過泡充血少于兩對(duì)照組(p=0.003)。不良事件中，A1組前房出血少于兩對(duì)照組(p=0.002);A1組虹膜反應(yīng)輕于兩對(duì)照組(p=0.000)。
　　 8．經(jīng)貝伐單抗干預(yù)后濾過泡內(nèi)生長(zhǎng)因子和受體的mRNA表達(dá)變化：貝伐單抗干預(yù)組（A1組）的濾過泡中，VEGF1

16、64.Flt-1、Flk1、TGFβ1和TGFβ2mRNA表達(dá)水平均較兩對(duì)照組顯著下調(diào)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；單眼濾過手術(shù)聯(lián)合PBS注射后（B組）的VEGF164mRNA在第1天增加，第2～5天達(dá)到峰值。A1組的VEGF164mRNA水平穩(wěn)定維持在較低水平；Flt-1mRNA表達(dá)豐度延時(shí)增高；TGFβ1mRNA在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（3～5天）表達(dá)豐度較其它組顯著降低；TGFβ2mRNA在各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)豐度較其它組顯著降低。TGFβ

17、2mRNA整體表達(dá)豐度在上述基因中最高，且表達(dá)波動(dòng)最大。
　　 9．經(jīng)貝伐單抗干預(yù)后濾過泡內(nèi)生長(zhǎng)因子和受體的蛋白表達(dá)變化：在多個(gè)時(shí)點(diǎn)，貝伐單抗干預(yù)組（A1組）的VEGF-A蛋白(44KD)、TGFβ1蛋白(25KD)、TGFβ2蛋白(48KD)的條帶濃度均低于兩對(duì)照組。
　　 [結(jié)論]：
　　 1．S-D大鼠結(jié)膜成纖維細(xì)胞存在VEGF及其受體(VEGFR1、VEGFR2)的表達(dá)以及炎癥因子(TGFβ1、TGFβ2