12-烷基化殼聚糖-反義內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶RNA表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合體納米粒在變應(yīng)性氣道炎癥中的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：本文主要探討了一種新的免疫調(diào)節(jié)治療模式：基于RNA干擾原理，我們構(gòu)建了反義內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶(antisenseECE)RNA表達(dá)質(zhì)粒，與12-烷基化殼聚糖(12-ACSs)包裹形成復(fù)合體納米粒，研究了該納米粒對(duì)卵蛋白(OVA)致敏激發(fā)變應(yīng)性氣道炎癥小鼠肺內(nèi)活性內(nèi)皮素(endothelin-1，ET-1)生成的影響，以及對(duì)變應(yīng)性氣道炎癥的免疫調(diào)節(jié)治療作用。 研究內(nèi)容和方法： 第一部分：12-ACSs/antisenseE

2、CE質(zhì)粒復(fù)合體納米粒的特性和體外基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率研究 通過透射電鏡觀察12-ACSs/antisenseECE質(zhì)粒復(fù)合體納米粒的形成、形態(tài)及大??；應(yīng)用凝膠阻滯、結(jié)合平衡、DNA沉淀和DNA酶消化實(shí)驗(yàn)等檢測12-ACSs對(duì)反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)合保護(hù)作用；通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測12-ACSs對(duì)細(xì)胞的毒性；通過離體培養(yǎng)細(xì)胞及活體動(dòng)物轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)觀察12-ACSs能否攜帶反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染。 第二部分：氣道給予12-ACS

3、s/antisenseECE質(zhì)粒復(fù)合體納米粒，觀察對(duì)OVA致敏小鼠變應(yīng)性氣道炎癥的影響 腹腔注射OVA致敏后OVA霧化激發(fā)，建立小鼠變應(yīng)性氣道炎癥模型，氣道給予包裹反義ECE質(zhì)粒的12-ACSs： 1.40只Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(N)組，OVA致敏激發(fā)并給予包裹反義ECE質(zhì)粒的12-ACSs(NM)組，OVA致敏激發(fā)(As)組，OVA致敏激發(fā)并給予裸DNA(DNA)組。除正常對(duì)照組，其它各組小鼠分別于第0、1

4、4日以O(shè)VA液腹腔注射致敏，第24、25、26日以O(shè)VA霧化激發(fā)，對(duì)照組用生理鹽水；NM組于激發(fā)前24小時(shí)氣道內(nèi)注入包裹反義ECE質(zhì)粒的12-ACSs，As組給予生理鹽水，DNA組給予裸DNA。 2.末次激發(fā)后24h進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BALF)，計(jì)算BALF中細(xì)胞總數(shù)、分類計(jì)數(shù)。 3.肺組織病理切片，HE染色，觀察各組小鼠肺組織的病理變化。 4.肺組織免疫組織化學(xué)檢查肺組織中α-SMA 5.分離培養(yǎng)各組

5、脾臟淋巴細(xì)胞，有或無OVA刺激培養(yǎng)脾細(xì)胞后取上清。制備肺勻漿上清。ELISA法檢測肺勻漿、脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-4、IL-5、IFN-γ、IL-10、IL-13和ET-1水平；BrdU法檢測各組細(xì)胞的增殖水平。 6.分離研磨小鼠肺臟，提取蛋白，WesternBlot檢測α-SMA表達(dá)變化。 第三部分：氣道給予antisenseECE質(zhì)粒復(fù)合體納米粒對(duì)OVA致敏變應(yīng)性氣道炎癥的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制 1.分離培養(yǎng)各組小鼠脾臟淋

6、巴細(xì)胞，以佛波酯、離子霉素刺激培養(yǎng)的脾細(xì)胞，莫能霉素作為阻斷劑，流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+CD4+/CD4-脾細(xì)胞及分泌IL-4、IFN-γ和CD4+CD25+的IL-10脾細(xì)胞比例。 2.分離研磨小鼠脾臟，提取核蛋白，WesternBlot檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子Foxp3表達(dá)變化。 結(jié)果： 第一部分：12-ACSs能夠攜載反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入離體培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞及小鼠在體氣道上皮 1.電鏡

7、觀察示成功制備包裹反義ECE質(zhì)粒的12-ACSs納米粒，粒徑在100-150nm之間。 2.DNA瓊脂糖凝膠電泳表明：12-ACSs與反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒在質(zhì)量比為1：1時(shí)，全部反義ECE質(zhì)粒被結(jié)合。應(yīng)用DNaseI消化后可見，不同于裸DNA組，12-ACSs包裹的反義ECE質(zhì)粒仍可在加樣孔里觀察到。 3.MTT檢測結(jié)果顯示：12-ACSs對(duì)16HBE細(xì)胞在低濃度下幾乎沒有毒性。 4.12-ACSs包裹的反義E

8、CE核酸表達(dá)質(zhì)粒的納米粒能成功轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞及活體動(dòng)物。 倒置熒光顯微鏡觀察示：分別添加antisenseECE質(zhì)?；?2-ACSs的16HBE細(xì)胞未見熒光。轉(zhuǎn)染12-ACSs/antisenseECE質(zhì)粒復(fù)合體納米粒的細(xì)胞可見綠色熒光，但表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞較對(duì)照脂質(zhì)體+antisenseECE質(zhì)粒組少。氣道內(nèi)滴注12-ACSs/antisenseECE質(zhì)粒復(fù)合體納米粒小鼠的肺組織冰凍切片觀察發(fā)現(xiàn)：小鼠的支氣管腔上皮

9、細(xì)胞區(qū)域可見反義ECE表達(dá)質(zhì)粒綠色熒光報(bào)告蛋白的表達(dá)。 第二部分：氣道給予12-ACSs包裹的反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒減輕了卵蛋白致敏小鼠氣道的變應(yīng)性炎癥 1.小鼠BALF細(xì)胞學(xué)檢查與N組小鼠相比，As組、DNA組和NM組細(xì)胞總數(shù)、Eos百分比與Eos絕對(duì)計(jì)數(shù)均顯著升高(P＜0.01)。NM組上述三種指標(biāo)均顯著低于As組和DNA組小鼠(P＜0.01)。As組和DNA組小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。在BALF細(xì)胞涂片中，N組基

10、本上看不見Eos，而在As組和DNA組可見顯著增多的Eos，NM組較As組和DNA組明顯減少。 2.小鼠肺組織病理改變與N組比較，As組和DNA組小鼠支氣管、細(xì)支氣管上皮下和小血管周圍可見明顯Eos浸潤為主的炎癥，NM組肺部炎癥改變較As組和DNA組減輕。 3.脾細(xì)胞培養(yǎng)上清、肺勻漿細(xì)胞因子檢測：在基礎(chǔ)狀態(tài)(無OVA刺激)下，脾細(xì)胞合成釋放ET、IL-4、IL-5及IL-13水平在NM、As組和DNA組均明顯高于N組(P

11、＜0.05或P＜0.01)，以上各細(xì)胞因子水平在NM組小鼠低于As組和DNA組(P＜0.05或P＜0.01)，IFNγ水平各組的差異無顯著性(P＞0.05)。NM、As組和DNA組脾細(xì)胞IL-10水平均低于N組(P＜0.05或P＜0.01)，但NM組IL-10的水平較As組和DNA組高(P＜0.05或P＜0.01)。肺勻漿結(jié)果同上述結(jié)果基本一致。OVA刺激后As組和DNA組脾細(xì)胞IL-4、IL-5和IL-13的釋放率顯著高于N組和NM組

12、(P＜0.05或P＜0.01)，NM組與N組比較無顯著差異。NM組IL-10的水平明顯高于As組和DNA組(P＜0.05或P＜0.01)，與N組比較無顯著差異，NM組IL-10的釋放率則顯著高于N組、As組和DNA組(P＜0.01)，IFN-γ、ET的釋放率在各組間無明顯差異。 4.免疫組織化學(xué)檢查肺組織中α-SMA表達(dá)：正常N組氣道上皮下僅見少量棕黃色α-SMA陽染，As組和DNA組小鼠氣道上皮下可見棕黃色陽染明顯增多，NM組

13、較As組和DNA組有一定程度減少，但仍較N組強(qiáng)。 5.α-SMA在各組均有表達(dá)；N組明顯少于其他3組，而As組和DNA組α-SMA的表達(dá)強(qiáng)于NM組。 第三部分氣道給予12-ACSs包裹的反義ECE質(zhì)粒對(duì)OVA誘導(dǎo)的變應(yīng)性氣道炎癥的免疫調(diào)節(jié) 1.四組小鼠脾細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：表達(dá)IL-4-CD4+：N(3.1％)，NM(3.3％)，As(5.9％)，DNA(6.6％)，表達(dá)IFN-γ-CD4：N(1.2％)，N

14、M(1.6％)，As(1.7％)，DNA(1.6％)；IL-4-CD8+的細(xì)胞在四組中分別是N(1.4％),NM(1.2％)，As(2.9％)，DNA(2.3％)，表達(dá)IFN-γ-CD8+的細(xì)胞在四組中分別是N(0.5％)，NM(0.3％)，As(0.3％)，DNA(0.3％)。表達(dá)IL-10-CD4+CD25+的細(xì)胞在四組中分別是N(1.9％)，NM(4.3％)，As(3.4％)，DNA(3.1％)。2.Foxp3在各組均有表達(dá)；N組

15、明顯少于其他3組，而NM組Foxp3的表達(dá)強(qiáng)于As組和DNA組。 結(jié)論：1.12-ACSs能夠成功包裹反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒并運(yùn)送到目的組織和細(xì)胞，反義ECE表達(dá)質(zhì)粒能夠在16HBE細(xì)胞及小鼠氣道表達(dá)，12-ACSs是一種相對(duì)低毒、安全的基因載體。 2.氣道內(nèi)給予包裹反義ECE核酸表達(dá)質(zhì)粒的12-ACSs納米粒治療，可以通過RNAi機(jī)制干擾內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶生成，限制大內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換為活性內(nèi)皮素，減少ET的合成，減輕變應(yīng)性氣道炎癥