南方紅豆杉根腐病病原及其拮抗芽孢桿菌研究.pdf

1、紅豆杉（Taxus spp.）是我國一級保護(hù)植物，世界珍稀樹種。它具有藥用、觀賞、綠化、特種優(yōu)質(zhì)用材等價(jià)值，特別是從根、莖、葉中提取的紫杉醇可加工成全球急需的抗癌新藥。天然紅豆杉資源非常有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)藥市場的需求，所以人工種植紅豆杉成為提取紫杉醇的主要途徑。南方紅豆杉（Taxuschinensis var.mairer）因出苗率較高（可達(dá)70％-80％）而常被選為優(yōu)良栽培種。近年來，隨著南方紅豆杉人工種植面積的擴(kuò)大，病害逐年加重，

2、尤其出現(xiàn)的苗期根腐病害相當(dāng)嚴(yán)重，給人們帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　本研究從雅安市洪雅縣天賜苗木有限公司某生產(chǎn)基地采集南方紅豆杉根腐病腐根樣本，進(jìn)行了病原鑒定和致病菌生物學(xué)特性研究，且從健康根際土壤中篩選了對病原菌有抑制作用的拮抗芽孢桿菌菌株，并對優(yōu)勢拮抗芽孢桿鎣菌株無菌發(fā)酵濾液的抑菌特性進(jìn)行了研究，研究結(jié)果如下:
　　1、對腐根樣本進(jìn)行常規(guī)組織分離，獲得7種不同性狀的分離物，采用柯赫氏法則(Koch's Postulate)

3、驗(yàn)證其致病性，篩選出可導(dǎo)致南方紅豆杉植株致病的分離物，結(jié)果顯示回接病株發(fā)病癥狀與生產(chǎn)基地南方紅豆杉根腐癥狀一致，對照無根腐現(xiàn)象出現(xiàn)。常規(guī)組織分離法分離回接發(fā)病的南方紅豆杉腐根，發(fā)現(xiàn)分離菌株與基地樣本分離物菌落形態(tài)一致，孢子形態(tài)一致。采用形態(tài)學(xué)特征觀察、致病性測定及rDNA—ITS序列分析等方法進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明該病原菌為半知菌亞門從梗孢目瘤座孢科鐮刀菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。
　　2、從培養(yǎng)基、pH、

4、溫度、碳氮源以及光照5個(gè)方面對南方紅豆杉根腐病致病菌進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)致病菌菌絲在PSA培養(yǎng)基上生長最好，在PDA+維生素B6培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大;(2) pH等于5～10時(shí)，致病菌能正常生長和產(chǎn)孢，菌絲生長和產(chǎn)孢最佳pH值為6～7;(3)致病菌在15～35℃溫度范圍內(nèi)能正常生長和產(chǎn)孢，最適溫度為25～30℃;(4)致病菌生長和孢子萌發(fā)的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為谷氨酸;(5)光暗交替最有利于致病菌的生長和產(chǎn)孢。

5、r>　　3、采集南方紅豆杉健康植株根際土壤，經(jīng)涂布培養(yǎng)篩選得到37株不同性狀的芽孢桿菌菌株，編號(hào)為B1～B37。以南方紅豆杉根腐病病原為靶標(biāo)菌，采用平板對峙培養(yǎng)法初篩出9株對南方紅豆杉病原有拮抗效果的芽孢桿菌菌株，分別為B6、B9、B15、B18、B20、B27、B30、B36、B37。對這9株芽孢桿菌菌株進(jìn)行復(fù)篩，最終獲得3株拮抗效果明顯（抑菌率都在30％以上）且具有抑菌廣譜性的菌株B6、B15和B37，其中B37抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶

6、達(dá)到10mm，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的潛力。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及16SrDNA同源性分析，并構(gòu)建16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定B6為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，B15為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens），B37為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa）。
　　4、試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B37對南方紅豆杉根腐病致病菌的拮抗效果最佳，對其無菌發(fā)酵濾液抑菌特性進(jìn)行研究。采用打孔

7、法測定B37無菌發(fā)酵濾液的生物活性，測定結(jié)果表明B37無菌發(fā)酵濾液對致病菌的抑菌作用具有穩(wěn)定性，具體表現(xiàn)為:(1)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，B37無菌發(fā)酵濾液抑菌活性逐漸增強(qiáng);(2)在不同pH、不同溫度、紫外線照射、與有機(jī)溶劑或蛋白酶K混合等條件下抑菌作用明顯且穩(wěn)定。將受B37無菌發(fā)酵濾液抑制的致病菌菌絲制成切片，在電子顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示致病菌菌絲絕大部分發(fā)生畸變、纏繞和扭曲，有的菌絲出現(xiàn)膨大、透明度增加，部分菌絲局部現(xiàn)串珠狀細(xì)胞，分生孢