糜蛋白酶途徑在敘利亞金黃地鼠胰島局部腎素血管緊張素系統(tǒng)的效應研究.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病是21世紀人類所面臨的主要疾病之一,是導致人群健康狀態(tài)下降和諸多血管疾病的主要因為。糖尿病及其并發(fā)癥不但使患者生活質量降低,同時也給整個社會帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。既往研究表明,胰島β細胞功能障礙則是2型糖尿病發(fā)生之核心所在。循環(huán)和局部的RAS活化可能是胰島β細胞功能損害的重要因素,可能籍此介導2型糖尿病發(fā)生發(fā)展。循證學研究指出阻斷RAS可以減少危險人群糖尿病的發(fā)生率,改善糖尿病患者的糖代謝紊亂,有可能成為

2、2型糖尿病防治研究的新靶點?；谏鲜鲇^點和結論,本課題組選擇敘利亞金黃地鼠離體胰島作為研究模型,深入研究Ang Ⅱ的生成途徑及病理條件下胰島局部RAS中AngⅡ的生成的變化,探索從糜蛋白酶途徑在局部RAS中對AngⅡ的生成貢獻以及阻斷該途徑可能帶來的胰島保護效應。希望在此基礎上進一步揭示2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展的病理生理機制,為2型糖尿病的發(fā)病和相關并發(fā)癥機制提供新的理論學基礎和依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 1.通過對麻醉

3、后敘利亞金黃地鼠胰腺的原位膽管內(nèi)插管、膠原酶Ⅴ灌注、水浴消化以及Ficoll密度梯度法純化、DTZ染色等方法獲取高存活率的敘利亞金黃地鼠的胰島細胞并對其進行功能鑒定。通過對高果糖聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)構建敘利亞金黃地鼠糖脂代謝異常的模型。
　　 2.探討糜蛋白酶抑素、卡托普利、α-抗胰蛋白酶、抑肽酶等不同抑制劑阻斷局部腎素血管緊張素系統(tǒng)后敘利亞金黃地鼠胰島細胞生成AngⅡ的變化。進一步分析敘利亞金黃地鼠胰島細胞局部RAS系統(tǒng)中Ang

4、Ⅱ生成的途徑并初步探討其形成的機制。探查血脂譜異常血癥敘利亞金黃地鼠胰島細胞生成Ang Ⅱ的變化。對比分析正常與病理狀態(tài)下敘利亞金黃地鼠胰島細胞局部RAS系統(tǒng)中AngⅡ生成的變化并探討相關機制。
　　 研究方法
　　 1.選取雄性敘利亞金黃地鼠,禁食24h后腹腔注射水合氯醛(3ml/kg)麻醉。開腹后順十二指腸找到主胰管,近腸端結扎膽總管及其分支。逆行穿刺膽管內(nèi)插管。注入膠原酶Ⅴ使胰腺充分膨脹。摘取胰腺立即置于消化瓶中3

5、7℃水浴消化。待消化完成后加入含血清培養(yǎng)液終止消化。收集沉淀液后以不連續(xù)密度梯度法純化胰島。將配好的DTZ溶液加入到純化后的沉淀之中,室溫避光染色后置于倒置顯微鏡下觀察并結合圖像分析軟件計數(shù)。利用臺盼蘭染色法測定胰島細胞活率。
　　 2.隨機選取健康雄性地鼠,以高脂高果糖飼料喂養(yǎng)。實驗開始前測量各組動物體重,并通過眼內(nèi)眥靜脈采血測血清膽固醇,甘油三酯,血肌酐,血糖。喂養(yǎng)后4周再次測量上述指標并記錄。
　　 3.倒置顯微鏡

6、下挑選經(jīng)分離純化后的敘利亞金黃地鼠胰島細胞加于24孔板中,加入含小牛血清的培養(yǎng)基預孵育30min。按標記分為①對照組、②卡托普利組、③糜蛋白酶抑素組、④抑肽酶組、⑤α-抗胰蛋白酶組以及⑥卡托普利+糜蛋白酶抑素組共6個組,各組均添加血管緊張素Ⅰ(0.02 μ mol/l)后再按組別依次加入PBS、卡托普利(終濃度1mmol/L)、糜蛋白酶抑素(終濃度1mmol/L)、抑肽酶(終濃度1mmol/L)、α-抗胰蛋白酶(終濃度50 μ g/ml

7、)、卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素(終濃度均為1mmol/L)干預胰島細胞。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120min后收集各孔液體,離心后取上清,采用競爭法ELISA檢測上清中Ang Ⅱ濃度。同時測定卡托普利、糜蛋白酶抑素、抑肽酶、α-抗胰蛋白酶及PBS原液中AngⅡ濃度排除試劑假陽性所致干擾。分離純化血脂譜異常血癥雄性敘利亞金黃地鼠胰島細胞,按照上述所提及相關方法加入各種抑制劑,之后同樣以競爭法ELISA檢測上清中AngⅡ濃度。
　　 研究結果

8、
　　 1.敘利亞金黃地鼠胰腺消化后經(jīng)DTZ染色觀察鏡下胰島細胞呈紅色或猩紅色。胰島細胞形態(tài)完整,胰島包膜清晰可見,折光性好,無破損,純化后胰島細胞基本不含外分泌腺組織。純化后每只地鼠胰腺可獲得胰島細胞近400個胰島細胞當量(IEQ),胰島純度>90％,胰島活率>9096。分離純化后的胰島經(jīng)體外培養(yǎng)1周后生長狀況良好。
　　 2.含高脂飼料喂養(yǎng)組與普食喂養(yǎng)組的敘利亞金黃地鼠血清甘油三酯,膽固醇差異明顯,但血葡萄糖,肌酐及

9、體重水平差異不具統(tǒng)計學意義。喂養(yǎng)前后,各組動物體重,膽固醇,甘油三酯,血糖,肌酐水平的差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 3.通過比較本實驗所加入的卡托普利、糜蛋白酶抑素、抑肽酶、α-抗胰蛋白酶及PBS原液的陰性對照結果發(fā)現(xiàn):除對照組中Ang Ⅱ濃度為82.49pg/ml,其余各組試劑原液Ang Ⅱ濃度均小于2.00pg/ml,所添加的各種試劑和抑制劑原液中基本不含Ang Ⅱ(P<0.01)。
　　 4.通過競爭ELISA法對干

10、預后胰島細胞局部Ang Ⅱ的檢測結果分析發(fā)現(xiàn):卡托普利組、糜蛋白酶抑素組、抑肽酶組、α-抗胰蛋白酶組以及卡托普利+糜蛋白酶抑素組中的AngⅡ較對照組減少。其中卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的Ang Ⅱ分別較對照組減少了42.50％和50.94％(P<0.01),但兩組間的差異無統(tǒng)計學意義。α-抗胰蛋白酶組和抑肽酶組的抑制效果雖不及前兩組,但分別較對照組減少了20.04％和18.67％(P<0.05)?？ㄍ衅绽?糜蛋白酶抑素組較對照組Ang

11、Ⅱ的生成銳減81.82％(P<0.01)。
　　 5.通過對病理狀態(tài)下即血脂譜異常血癥狀態(tài)下胰島細胞局部Ang Ⅱ的檢測結果分析發(fā)現(xiàn):各干預組AngⅡ均較對照組減少。其中卡托普利組和糜蛋白酶抑素組中的Ang Ⅱ分別較對照組減少了39.49％和56.7005,與之前不同的是,卡托普利組和糜蛋白酶抑素組在此項研究中對Ang Ⅱ抑制呈現(xiàn)出統(tǒng)計學差異。α-抗胰蛋白酶組和抑肽酶組的抑制效果仍然不如上述兩組明顯,分別較對照組減少了22.02

12、％和24.88％,卡托普利聯(lián)合糜蛋白酶抑素組較對照組Ang Ⅱ的生成減少了78.34％。
　　 研究結論
　　 1.原位膽管內(nèi)插管聯(lián)合膠原酶灌注消化可獲取高純度、高活率的敘利亞金黃地鼠胰島細胞。
　　 2.經(jīng)短期高脂飼料喂養(yǎng)已經(jīng)可以構建敘利亞金黃地鼠血脂譜異常血癥的動物模型。
　　 3.敘利亞金黃地鼠胰島局部血管緊張素Ⅱ的生成除經(jīng)典的血管緊張素轉換酶途徑之外還存在有糜蛋白酶途徑。正常敘利亞金黃地鼠中由血管