HSA-Dopamine-Fe304納米顆粒的磁特性及相關(guān)分子影像學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 分子成像是一個(gè)迅速崛起的生物醫(yī)學(xué)研究手段和臨床學(xué)科,其目標(biāo)是無創(chuàng),定量可視化發(fā)生在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的體內(nèi)分子過程。一般來說,分子成像的應(yīng)用要求快速、敏感、高分辨率力的影像技術(shù),結(jié)合使用對(duì)比劑從而使細(xì)胞和亞細(xì)胞水平生物過程能夠可視化。至目前為止,單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(SPECT),正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET)和光學(xué)成像(Optical imaging)技術(shù)仍然是體內(nèi)臨床前分子影像最常用的影像方法,其主

2、要原因是這些方法高的敏感性。然而核成像技術(shù)(PET/SPECT)使用電離輻射,沒有提供解剖信息且空間分辨率力低,而光學(xué)成像空間分辨力低且深度穿透力受限。因此,近年來磁共振(MR)被引入作為替代方法,由于這個(gè)技術(shù)提供極好的內(nèi)在高空間分辨力的軟組織對(duì)比和無電離輻射。此外,該技術(shù)能夠在單次試驗(yàn)通過結(jié)合不同的成像系列提供解剖信息和彌散,灌注和血流等生理參數(shù)。MR已經(jīng)成為分子影像的一個(gè)重要工具,然而MRI的缺點(diǎn)是對(duì)于MR造影劑的低敏感性,因此采用

3、不同策略提高造影劑的效力,如研發(fā)新穎的納米顆粒將使MR成像更有利于適合分子影像。
　　 應(yīng)用MRI結(jié)合鐵氧顆粒(IONP)為基礎(chǔ)的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)提供一個(gè)良好解決在宿主器官內(nèi)非侵襲性追蹤移植細(xì)胞的方法,但這個(gè)技術(shù)的主要挑戰(zhàn)是誘導(dǎo)充足數(shù)量的顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以彌補(bǔ)細(xì)胞分裂所引起的稀釋效應(yīng),而不影響正常細(xì)胞功能。對(duì)于細(xì)胞標(biāo)記,盡管SPIO顆粒很容易被巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),然非吞噬細(xì)胞及分裂慢的細(xì)胞鐵氧磁性納米顆粒吸入?yún)s很少,因此有效的細(xì)胞

4、標(biāo)記需要高濃度的納米顆粒,但這經(jīng)常引起細(xì)胞毒性。當(dāng)前,提高對(duì)比劑內(nèi)化的一些方法已經(jīng)提出并進(jìn)行了研究,最常用方法是利用商業(yè)化Feridex結(jié)合轉(zhuǎn)染試劑,然而,其缺少通用的公式,試驗(yàn)冗長和單細(xì)胞系要獲得最優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果易發(fā)生錯(cuò)誤。
　　 鑒于上述因素,本研究應(yīng)用MR及新穎高磁矩的磁共振分子成像對(duì)比劑-人血清白蛋白-多巴胺-四氧化三鐵氧納米顆粒(Human serum albumin-Dopamine-Fe3O4 Nanoparticl

5、es,HSA-IONPs)進(jìn)行分子影像學(xué)研究,通過與商業(yè)應(yīng)用的Feridex納米顆粒對(duì)比研究,研究HSA-IONPs磁特性,各種不同細(xì)胞系HSA-IONPs(終濃度為201μg·ml-1鐵)細(xì)胞標(biāo)記的有效性,并在不同動(dòng)物模型中應(yīng)用HSA-IONPs標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞行MR分子成像。
　　 第一部分、HSA-Dopamine-Fe3O4納米顆粒合成及磁特征
　　 目的：合成HSA-Dopamine-Fe3O4納米顆粒

6、(HSA-IONPs)-新穎的磁共振分子成像對(duì)比劑并研究其磁特性。
　　 方法：油酸涂層鐵氧顆粒(15nm)來自O(shè)cean NanoTech公司。對(duì)于表面修飾,大約50mg油酸涂層鐵氧顆粒分散在5ml氯仿內(nèi),20mg多巴胺溶解在2ml DMSO內(nèi)并加入上述油酸涂層鐵氧顆粒的氯仿內(nèi),形成一均質(zhì)溶液,混和溶液加熱至70℃后一小時(shí),涼至室溫。已烷作為不良溶劑用于沉淀納米顆粒,15000g離心15min收集納米顆粒后,用氮?dú)獯蹈?在超聲

7、波的作用下重新分散納米顆粒進(jìn)入DMSO。另外,把20mg HSA(人血清白蛋白)溶解在硼酸鹽緩沖劑(50nM,PH8.5),在超聲作用下,把溶解在DMSO的納米顆粒滴加至HSA溶液內(nèi)。合成產(chǎn)物在PBS(PH7.4)溶液中透析(MWCO12000-14000)24h以便交換緩沖液并除去游離的多巴胺,此后,得到的納米顆粒再次離心,30000g離心20min以去除游離的HSA,產(chǎn)物重分散于PBS緩沖液內(nèi),小部分聚集物通過注射過濾器(0.22μ

8、m)移除。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AMS)、透射電子顯微鏡(TEM)、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)、Zeta電位及MRI對(duì)納米顆粒進(jìn)行定量和特征,尾靜脈注射Feridex和HSA-Dopamine-Fe3O4納米顆粒(10mg Fe/kg)進(jìn)入正常裸鼠體內(nèi)后,在不同時(shí)間點(diǎn)行肝臟MR T2W成像。
　　 結(jié)果：DLS測量分散狀態(tài)的HSA-IONPs流體動(dòng)力學(xué)結(jié)果是28.4nm,TEM顯示合成的納米顆粒呈單分散單晶體和圓形結(jié)

9、構(gòu),無團(tuán)塊聚集現(xiàn)象。Zeta電位結(jié)果顯示HSA-Dopamine-Fe3O4納米顆粒呈負(fù)電荷(-9.46±1.86MV)。MR Phantom結(jié)果顯示HSA-IONPs的R2值(R2值=314.5mM-1S-1)明顯高于常規(guī)應(yīng)用的Feridex納米顆粒(Fefidex R2值=123.6mM-1S-1),HSA-IONPs顯示更好的T2對(duì)比,HSA-IONPs可應(yīng)用于肝臟成像。
　　 結(jié)論：HSA-Dopamine-Fe3O4納

10、米顆粒具有更高的磁矩,優(yōu)于商業(yè)應(yīng)用的鐵氧顆粒(Fefidex)。
　　 第二部分、HSA-Dopamine-Fe3O4細(xì)胞標(biāo)記的有效性
　　 目的：研究新型的磁共振分子成像對(duì)比劑HSA-IONPs細(xì)胞標(biāo)記的有效性。
　　 方法：在不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用HSA-IONPs和Feridex(20μg Fe·ml-1)納米顆粒孵育人前列腺癌PC3細(xì)胞、人頭頸磷狀細(xì)胞癌UMSCC-22B細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞

11、、巨噬細(xì)胞。行普魯氏藍(lán)染色,核固紅反染。MTT分析用于評(píng)估納米顆粒的毒性作用。神經(jīng)干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬的納米顆粒應(yīng)用ICP-AMS、TEM及MR Phantom成像進(jìn)行定量和特征。雙側(cè)大腦基底節(jié)立體定向注射納米顆粒標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞(1×104)后6h,行MR T2w掃描;建立MCAO腦中風(fēng)模型,靜脈注射巨噬細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)(掃描前、4h、1d、2d、5d、7d)行MR掃描。
　　 結(jié)果：低濃度20μg/ml HSA-IONPs

12、即可有效孵育細(xì)胞,且不需要轉(zhuǎn)染試劑。TEM見納米顆粒位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體/溶酶體內(nèi),納米顆粒有聚集改變。HSA-IONPs對(duì)研究細(xì)胞系的生長和分裂沒有顯著性毒性影響(P＜0.05)。與Feridex組相比,ICP-AMS結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞和巨噬細(xì)胞HSA-IONPs組呈現(xiàn)更高的納米顆粒吸收。HSA-IONPs或Fendex加轉(zhuǎn)染試劑(50μg Fe·ml-1+Lipofactamine2000)孵育神經(jīng)干細(xì)胞24h,與Feridex相比納

13、米顆粒吸收有顯著性差異。神經(jīng)干細(xì)胞納米顆粒的孵育濃度與細(xì)胞吸收的鐵量呈相關(guān)依賴性。MR細(xì)胞Phantom成像顯示T2WI信號(hào)強(qiáng)度有顯著性差異,未飽和前,R2值與細(xì)胞數(shù)量呈良好的線性相關(guān)關(guān)系。體內(nèi)MR及病理證實(shí)HSA-IONPs孵育的神經(jīng)干細(xì)胞比Feridex孵育吸收更多的鐵量。MR掃描可用來追蹤局灶性腦缺血中風(fēng)后標(biāo)記的巨噬細(xì)胞遷移。
　　 結(jié)論：HSA-Dopamine-Fe3O4細(xì)胞標(biāo)記有效且優(yōu)于Feddex。
　　

14、第三部分、HSA-Dopamine-Fe3O4腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞MR成像可行性
　　 實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)MR成像可行性。
　　 方法：應(yīng)用HSA-IONPs(20μg/ml Fe)孵育巨噬細(xì)胞(RAW264.7)24h,經(jīng)尾靜脈注射5×106標(biāo)記巨噬細(xì)胞至皮下4T1荷瘤BALB/c小鼠和22B荷瘤裸鼠,在不同時(shí)間點(diǎn)(掃描前、注射后6h、1、2、3或7d),采用7.0 TMR掃描儀

15、行T2W橫、冠狀位掃描,動(dòng)物處死后腫瘤及臟器行病理檢查。
　　 結(jié)果：普魯士藍(lán)染色、電鏡及細(xì)胞Phantom成像證實(shí)細(xì)胞標(biāo)記有效。注射后6h4T1腫瘤壞死囊變中心周圍見明顯低信號(hào)影,24h見壞死區(qū)與腫瘤實(shí)質(zhì)區(qū)交界部位有不規(guī)則環(huán)形低信號(hào)影;22B腫瘤注射后6h MRI見多發(fā)散在灶性低信號(hào)影,24h點(diǎn)片狀低信號(hào)影縮小;兩種腫瘤注射后2、3或7d MRI形態(tài)、位置和24h相似,但信號(hào)強(qiáng)度遞減,病理證實(shí)標(biāo)記的巨噬細(xì)胞存在,與影像結(jié)果一致