異育銀鯽粘孢子蟲PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、異育銀鯽是我國重要的鯽魚養(yǎng)殖品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各類病害接踵而至，病害問題已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素，尤其是粘孢子蟲病，嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的苗種培育和成魚養(yǎng)殖。其中，武漢單極蟲、洪湖碘泡蟲、吳李碘泡蟲及丑陋圓形碘泡蟲對異育銀鯽的危害最為嚴(yán)重，不僅影響宿主的生長發(fā)育，使商品魚失去應(yīng)有的經(jīng)濟價值，嚴(yán)重時甚至引起感染魚的大量死亡。為有效控制粘孢子蟲病害，亟需建立異育銀鯽重要寄生粘孢子蟲的快速、準(zhǔn)確、實用的檢測方法。因此

2、，本研究以這4種粘孢子蟲為研究對象，建立單輪PCR與多重PCR檢測方法，以期為粘孢子蟲病的快速診斷與防治提供技術(shù)支持。
　　1.4種粘孢子蟲單輪PCR檢測方法的建立:分別以武漢單極蟲的28S rDNA、洪湖碘泡蟲與吳李碘泡蟲的ITS-5.8S rDNA、丑陋圓形碘泡蟲的18S rDNA基因為分子靶標(biāo)，各篩選一對特異性引物，特異性產(chǎn)物大小依次為245bp、447bp、590bp、894bp。試驗證明4對引物的特異性與通用性良好，無非

3、特異性擴增干擾，對非目的粘孢子蟲無交叉反應(yīng)。靈敏性試驗結(jié)果顯示，四種單輪PCR方法的檢測靈敏性均達到了Pg級水平。
　　2.4種粘孢子蟲多重PCR檢測方法的建立:在上述建立的單輪PCR基礎(chǔ)上，將4對引物置于同一個PCR體系，通過反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化，成功在同一個反應(yīng)體系中擴增出4條目的條帶，且能明顯區(qū)分，無非特異性擴增干擾。靈敏性試驗顯示，建立的多重PCR方法對四種粘孢子蟲的檢測靈敏性均達到了ng級水平。
　　3.兩種PCR