用于癌癥標(biāo)志物早期診斷的免疫磁性微球的制備及評(píng)價(jià).pdf

1、惡性腫瘤在我國已成為導(dǎo)致人們死亡的第一位疾病，要攻克腫瘤，診斷是關(guān)鍵的一步，現(xiàn)有的腫瘤診斷和篩查技術(shù)要么價(jià)格昂貴、要么靈敏度低，往往是在腫瘤發(fā)生到一定階段才能發(fā)現(xiàn)，存在嚴(yán)重不足。一種解決思路是利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，研發(fā)一種新型免疫磁性微球，將其作為腫瘤標(biāo)志物的捕獲探針，對(duì)人體血液或體液中的腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行捕獲，再利用放大探針將捕獲的標(biāo)記物信號(hào)進(jìn)行放大并檢測(cè)，以期能進(jìn)一步提高腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的靈敏度，簡化檢測(cè)步驟，降低檢測(cè)成本。

2、本課題組對(duì)上述思路中的免疫磁性微球進(jìn)行制備，以人源IgG模擬腫瘤標(biāo)志物，采用2～3μm功能化磁性微球與抗體偶聯(lián)，制備了具有結(jié)合活性的免疫磁性微球。采用125I標(biāo)記抗原及抗體，通過對(duì)放射性同位素的檢測(cè)對(duì)偶聯(lián)工藝進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，考察了各影響因素對(duì)抗體偶聯(lián)效果的影響。對(duì)所制備的免疫磁性微球進(jìn)行了初步性能評(píng)價(jià)。 市售磁性微球表面功能基數(shù)量少，品種單一，限制了磁性微球的進(jìn)一步多功能化。多糖微球表面功能基團(tuán)種類豐富，易于改性，且表面功能基團(tuán)分

3、布密集，可以引入更多抗體。以普魯蘭為例，優(yōu)化多糖微球的合成條件，對(duì)免疫微球的進(jìn)一步改進(jìn)打下基礎(chǔ)。 磁性微球可以通過磁場(chǎng)富集，用于體外檢測(cè)試劑載體，在疾病診斷上有重要用途。也可用于藥物載體，通過磁場(chǎng)定位達(dá)到靶向給藥的目的。為了拓展體內(nèi)檢測(cè)試劑載體的研究，本文設(shè)計(jì)合成一類具有pH/溫度雙重敏感性的、可生物降解的兩親性聚丙烯酰胺衍生物—co—聚氨基酸聚合物，通過高分子自組裝的方法形成納米微球，作為下一步合成多重靶向藥物載體的前期基礎(chǔ)。

4、 本文具體研究內(nèi)容如下： 一、磁性微球與抗體的偶聯(lián)方法的考察。 選用2～3μmSiO2磁性微球，分別連接有不同間隔臂的胺基、羧基等功能基，與帶有熒光標(biāo)記的抗體通過不同的方法進(jìn)行偶聯(lián)，再與帶有熒光標(biāo)記抗原進(jìn)行吸附，通過激光共聚焦檢測(cè)偶聯(lián)情況，對(duì)磁球與抗體、抗體偶聯(lián)情況進(jìn)行定性研究。選定出工藝簡便、偶聯(lián)效果好的偶聯(lián)方法。 二、磁性微球—抗體與抗原吸附定量考察及其穩(wěn)定性考察。 采用放射性同位素標(biāo)記的方法

5、進(jìn)行定量研究。 對(duì)選定的偶聯(lián)方法進(jìn)行進(jìn)一步工藝優(yōu)化，得出最佳的偶聯(lián)條件，并對(duì)免疫磁性微球進(jìn)行穩(wěn)定性考察。 在此基礎(chǔ)上逐步降低抗原的濃度，確定抗原最小檢測(cè)濃度。 三、蛋白G定向偶聯(lián)磁性微球與抗體的工藝研究。 EDC化學(xué)偶聯(lián)方法是將抗體無規(guī)則地連接在磁性微球上，而采用蛋白G可通過對(duì)IgG的Fc區(qū)的結(jié)合，實(shí)現(xiàn)抗體與磁性微球的定向偶聯(lián)?？疾炜贵w定向偶聯(lián)條件，并研究了pH值對(duì)抗體檢測(cè)回收率的影響。 四、普魯

6、蘭微球的制備工藝的考察。 以正庚烷—四氯化碳為油相、Span—80為乳化劑，采用反相乳化法制備粒徑可控的普魯蘭微球?？疾炱蒸斕m濃度、水油比、攪拌速度、乳化劑用量等因素對(duì)微球的大小、形態(tài)的影響。為下一步制備各種功能化磁性微球并與SiO2微球進(jìn)行比較研究，奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 五、溫度PH敏感性材料P(NiPAAm—co—DMAA)—co-P(L—Ala)的制備。 通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)合成一種帶有活性—NH2

7、基團(tuán)的溫度敏感性親水型共聚物P(NiPAAm—co—DMAA)，并將其作為引發(fā)劑，引發(fā)丙氨酸的陰離子聚合。所合成的P(NiPAAm—co—DMAA)—co-P(L—Ala)的PDI在1.3左右。聚合物可以通過自組裝的方式形成納米膠束。利用透射電鏡(TEM)研究了膠束的粒徑分布和形態(tài)。結(jié)果表明，膠束大小在200～300nm左右，具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)。共聚物的最低臨界溶解溫度(LCST)為45.5℃。溫度低于LCST時(shí)，聚合物溶解形成膠束；高

8、于LCST時(shí)，膠束解離，聚合物不溶。聚合物對(duì)溫度的響應(yīng)是快速而可逆的。 綜上所述，本論文制備了免疫磁性微球，并討論了磁性微球上的功能基團(tuán)、偶聯(lián)劑、間隔臂、以及其他實(shí)驗(yàn)因素對(duì)偶聯(lián)效果的影響，其抗體偶聯(lián)量最高為31.33±2.16μg/0.1mg磁性微球，抗原吸附量最高為34.78±0.36μg/0.1mg磁性微球。所制免疫磁性微球?qū)θ嗽碔gG的檢測(cè)極限水平可達(dá)50pg/ml，對(duì)人源IgG吸附率為65.96±6.99％。且穩(wěn)定性較好

9、，在37℃60轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng)條件下存放5天，抗體脫落量僅有13％。考察了蛋白G法定向連接抗體工藝，其抗體連接量最高為1.26±0.03μg/0.1mg磁性微球，抗原吸附量為2.45±0.10μg/0.1mg磁性微球。相比非定向化學(xué)連接工藝來說，定向連接工藝的抗體利用率較高，可有效地結(jié)合抗原，但抗體連接量較低。 本實(shí)驗(yàn)為免疫磁性微球在腫瘤標(biāo)記物早期診斷方面的應(yīng)用提供了參考。另外，本論文還研究粒徑可控的普魯蘭微球以及溫度pH敏感納米膠