Vav1在吲哚胺2，3雙加氧酶抑制T淋巴細胞活性中的功能及機制探討.pdf

1、目的： 通過對Vav1與腫瘤浸潤T淋巴細胞（tumor infltrating T lymphocytes，TIL-T）活性的研究，提出腫瘤誘導的T細胞失能的分子機制；初步探討TIL-T中Vav1基因的表達情況及其與腫瘤局部微環(huán)境中吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）的表達的相關性，提出腫瘤誘導的T細胞失能的一個可能的分子機制；分析IDO對T細胞活性、Vav1基因和蛋白表達水平，

2、Vav1蛋白磷酸化及其下游信號分子[Ca2+]流、MAPK、NF-κB等的影響，同時測定IL-2基因的表達水平。提出TIL-T中Vav1信號異常的可能機制；提出調控TIL-T活性的方法，為糾正腫瘤誘導的免疫抑制提供新的解決方法。 內容： 1）檢測TIL-T中Vav1 mRNA的表達水平，分析其與T細胞活性、腫瘤局部IDO表達水平的相關性。 2）體外以穩(wěn)定表達IDO的CHO細胞與T細胞共孵育，觀察IDO對T細胞增殖

3、、凋亡的影響，以及對Vav1基因、蛋白表達及Vav1蛋白活化的作用；觀察IDO對T細胞中Vav1下游信號主要傳導途徑[Ca2+]流、MAPK及NF-κB的變化。探討IDO在調控Vav1表達和活化中的作用，以及Vav1進一步調節(jié)T細胞活性的機制。 3）將IDO抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）加入共孵育體系，觀察T細胞增殖、凋亡以及Vav1信號途徑的變化。 方法： 1）無菌條件下分離肺癌原位TIL-T及惡性胸腹水中的

4、T淋巴細胞，在體外加入刺激活化因子，觀察T淋巴細胞對刺激的反應性，同時檢測T細胞中Vav1基因的表達水平；再用免疫組化的方法觀察肺癌原位腫瘤組織中IDO蛋白的表達情況。 2）體外以穩(wěn)定表達IDO的CHO細胞株與外周血正常T細胞共同培養(yǎng)，MTT法檢測T淋巴細胞的增殖率，流式細胞儀檢測T細胞凋亡，Real-time PCR法檢測Vav1和IL-2 mRNA水平，Western blot免疫印跡和免疫沉淀的方法檢測Vav1蛋白表達及磷

5、酸化水平，及其下游分子ERK1/2、p38和IκBα的活化；應用細胞鈣離子成像系統(tǒng)檢測單細胞內[Ca2+]i的動態(tài)變化。 3）以IDO抑制劑1-MT加入共孵育體系，觀察T細胞增殖、凋亡以及Vav1基因蛋白表達水平和下游信號途徑的變化。 結果： 1）在11例肺癌患者腫瘤原位手術標本中，3例TIL-T對活化刺激信號的反應性低下，只表現(xiàn)為極微的增殖反應；其余8例TIL-T對刺激信號的反應正常，可正常增殖。同樣用刺激活化

6、信號在體外對10例癌癥患者癌性胸腹水中T淋巴細胞進行激活，我們觀察到，所有病例所采集的T細胞均能正常增殖。 2）利用Real-time PCR的方法對肺癌原位TIL-T和癌性胸腹水中分離得到的T淋巴細胞中Vav1的mRNA含量進行了檢測，結果顯示可分為兩組：對刺激信號反應正常的8例肺癌原位TIL-T和癌性胸腹水中的T細胞中，Vav1 mRNA含量與正常對照差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。而3例表現(xiàn)為“失能”狀態(tài)的T細胞中Vav

7、1的mRNA水平卻非常低（P<0.05）。 3）免疫組化檢測顯示所觀察的肺癌患者標本中IDO陽性表達率為27.3%，肺癌原位組織及轉移性淋巴結中IDO表達呈一致性。3例IDO表達陽性的肺癌組織，其中浸潤T淋巴細胞中Vav1基因表達水平較對照組下降；8例IDO表達陰性的肺癌組織Vav1基因表達水平與對照組的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。IDO表達陽性的3例標本中TIL-T對活化刺激信號的反應性低下。 4）穩(wěn)定表達IDO

8、的CHO細胞株經檢測穩(wěn)定表達IDO mRNA和蛋白，表達的IDO經氨基酸檢測分析可分泌至細胞外并且發(fā)揮活性；將此細胞與T細胞共孵育后，T細胞增殖下降，凋亡增加；Vav1 mRNA及蛋白水平下降，磷酸化水平降低，而且Vav1下游分子的活化水平均降低；同時IL-2基因的表達下降。 5）1-MT加入共孵育體系后，T細胞增殖及凋亡均可部分恢復，Vav1 mRNA及蛋白水平也可部分恢復。 結論： 1）Vav1基因的表達與腫

9、瘤局部浸潤的T淋巴細胞的活性具有相關性，與腫瘤局部微環(huán)境中IDO的表達水平具有相關性。部分肺癌原位腫瘤局部浸潤的T淋巴細胞呈現(xiàn)為功能抑制狀態(tài)，在這些“失能”細胞中信號傳導蛋白Vav1的表達下降。免疫組化結果提示IDO可能是腫瘤局部微環(huán)境中影響T細胞中Vav1蛋白表達和活化的重要因素之一。 2）IDO抑制T細胞增殖，誘導T細胞凋亡。IDO對TCR信號傳導通路具有調節(jié)作用。IDO及其代謝產物可能通過抑制T細胞中信號傳導蛋白Vav1及

10、其下游分子的表達和活化而抑制T細胞功能。 3）Vav1的低表達和活化障礙，導致其下游分子的活化障礙，以致IL-2因子的合成和分泌減少，使T細胞增殖抑制。Vav1的下調與T細胞的凋亡是否有關仍需進一步探索。 4）Vav1信號通路在IDO誘導的T細胞凋亡中的作用尚需進一步探索。本研究為進一步探討IDO在病理或生理情況下對T細胞的抑制作用提供了另一個研究方向，初步探索了調控腫瘤局部T淋巴細胞功能的方法，同時為抗腫瘤免疫治療方法