胸腔積液中腫瘤細(xì)胞血管管型生成結(jié)構(gòu)的觀察與研究.pdf

1、前言：
　　 腫瘤是典型的血管依賴性病變,其必須建立自己的血管網(wǎng)絡(luò)從而打破宿主內(nèi)在微環(huán)境的平衡進(jìn)行生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。血管生成擬態(tài)(vasculogeniemimicry,VM)的提出豐富了腫瘤血管生成理論,其特點(diǎn)是在人眼葡萄膜黑色素瘤中可以看到無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞的管道,管道內(nèi)壁沒(méi)有血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆,腫瘤細(xì)胞模仿機(jī)體血管生成在管壁外表面排列取代內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成血供通道,管道內(nèi)可見(jiàn)流動(dòng)的紅細(xì)胞。我們?cè)诩?xì)胞病理學(xué)中發(fā)現(xiàn)肺源性非小細(xì)胞肺癌(NSCL

2、)患者胸腔積液離體后進(jìn)行石蠟包埋切片后腫瘤細(xì)胞之間互相連接形成中空管腔樣結(jié)構(gòu),我們將這樣的結(jié)構(gòu)成為“腫瘤細(xì)胞血管樣管型”,并推斷NSCLC胸腔積液在缺少細(xì)胞外基質(zhì)支持和缺氧的條件下腫瘤細(xì)胞為了自身的生存,便于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換、代謝甚至是再轉(zhuǎn)移也可以分化成腫瘤細(xì)胞血管管型的形態(tài)擔(dān)當(dāng)起血管和淋巴管的功能,對(duì)離體的腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣。
　　 目的：
　　 探討腫瘤細(xì)胞血管管型與組織及細(xì)胞系中VM之間的區(qū)別和聯(lián)系。證明腫瘤細(xì)胞

3、血管管型結(jié)構(gòu)是否具有血管及淋巴管內(nèi)皮標(biāo)記物的表達(dá),并將觀察到的管腔結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)分類(lèi)。建立裸鼠腫瘤模型,在組織學(xué)水平進(jìn)一步證實(shí)腫瘤細(xì)胞血管管型的存在。
　　 材料與方法：
　　 1、材料
　　 收集2010年1月至2011年12月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門(mén)診及病房胸腔積液,優(yōu)選以腫瘤細(xì)胞為主、炎性細(xì)胞較少(腫瘤細(xì)胞約占整張切片的95%以上)未接受過(guò)治療的100例NSCLC胸腔積液作為研究對(duì)象(經(jīng)臨床表現(xiàn)、CT、MR

4、等臨床資料及41.5%的患者進(jìn)一步做肺部腫瘤進(jìn)行肺穿后進(jìn)組織病理學(xué)診斷為NSCLC,另外100例良性胸腔積液標(biāo)本作為對(duì)照。這50人中男性為104人,女性為96人,年齡從30歲至82歲,平均年齡均為61歲。
　　 2、液基細(xì)胞薄層檢測(cè)技術(shù)(TCT):
　　 收集新鮮胸水20ml左右,室溫下800r/min離心5分鐘,棄去上清,取沉淀底層細(xì)胞,加入清洗液后再次離心。取沉淀與保存液混合后機(jī)器Thinprep2000自動(dòng)制片。<

5、br>　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　 CD31(SC-71872)、CD105(SC-2048)、CD34(SC-65261)、D2-40(SC-50415)、LYVE-1(SC-31290)、TTF-1(SC-53136)、CK5&6(SC-60041)、CK7(SC-35155)均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司,CDl33(130-094-913)購(gòu)自德國(guó)美天旎公司。采用鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶(streptavidi

6、n-peroxidase,SP)法,PBS緩沖液代替第一抗體作為空白對(duì)照,DAB顯色,蘇木素復(fù)染。常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)膠封片。
　　 4、免疫熒光染色方法
　　 免疫熒光雙染法法檢測(cè)CD31、CD34、CDl05、D2-40、LYVE-1的表達(dá)定位。將選出的切片放于69℃烤片機(jī)上2小時(shí),后二甲苯中脫蠟,酒精脫苯,高溫高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)。非免疫動(dòng)物血清37℃封閉30分鐘,滴加一抗(1:100稀釋,選擇不同二抗的一抗按1:1

7、比例兩兩混合),4"孵育過(guò)夜;免疫熒光二抗(1:500稀釋,不同種屬二抗按1:1兩兩混合),,37"C孵育30分鐘。DAPI復(fù)染細(xì)胞核。50%緩沖甘油封片,熒光顯微鏡Nikon90i下觀察并照相。孵育二抗以后步驟均在避光條件下進(jìn)行。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn):用等量的0.01mol/LPBS代替一抗,其余步驟同前。結(jié)果判定:以細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)明亮的綠色和紅色熒光信號(hào),合成后為黃色的熒光信號(hào)定位為陽(yáng)性。
　　 5、WestemBlot蛋白印跡

8、r>　　 檢測(cè)血管及淋巴管上皮因子的表達(dá)水平。在70例NSCLC患者胸腔積液,30例炎性及增生胸腔積液中檢測(cè)CD31、CD34、CDl05、LYVE-1的蛋白水平。蛋白從胸腔積液細(xì)胞中提取,冰上超聲處理,4℃靜置,孵育50min,4℃離心20min(800r/min),提取上清,放入-70℃冰箱里保存。使用前用Brodford法測(cè)定蛋白濃度,每孔80μg蛋白加入10%SDS-PAGE凝膠電泳后,40V(LYVE-1)、80V(CD31

9、、CD34、CD105)條件下濕電轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)入0.22μmPVDF膜,5%脫脂奶粉封閉液封閉2h,一抗(1:100稀釋)4℃過(guò)夜,后用TTBS沈膜,二抗(1:1000稀釋),X底片曝光,顯影,定影后拍照,以β-actin為內(nèi)參,用凝膠成像及分析系統(tǒng)(BiolmagingSystems,美國(guó))分析蛋白各條帶的灰度值,每組結(jié)果均為相同條件重復(fù)3次。Westernblotting試驗(yàn)中使用的試劑包括:CD31(SC-71872)、CDl0

10、5(SC-2048)、CD34(SC-65261)、LYVE-1(SC-31290)均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司。
　　 6、裸鼠NSCLC胸腔積液移植腫瘤動(dòng)物模型
　　 雌性BALB/C裸鼠24只,4～6周齡,體重18～24g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,裸鼠在恒溫18～22℃、恒定濕度(50～80%)的SPF層流罩中飼養(yǎng),自由攝入無(wú)菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和無(wú)菌水,合格證編號(hào)2007000519646。將診斷為非小細(xì)胞肺

11、癌患者胸腔積液中腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后移植到裸鼠背部皮下,并于1天、3天、7天、14天解剖取出腫瘤包塊進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。
　　 7、肺源性非小細(xì)胞肺癌患者肺穿后固定包埋,HE染色
　　 8、統(tǒng)計(jì)分析
　　 各組資料利用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 NSCLC患者胸腔積液TCT中均發(fā)現(xiàn)緊密彩球狀、鱗片狀或是燈泡狀聚集的腫瘤細(xì)胞,對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本

12、包埋、切片HE染色后可觀察到單個(gè)、兩個(gè)甚至多個(gè)腫瘤細(xì)胞組成的血管樣管型結(jié)構(gòu),并將發(fā)現(xiàn)的血管樣結(jié)構(gòu)歸納為13種形態(tài)結(jié)構(gòu);血管、淋巴管內(nèi)皮因子的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫熒光染色、Western-blot結(jié)果均為陽(yáng)性表達(dá);裸鼠腫瘤細(xì)胞移植模型在建立的第7天的腫瘤包塊可見(jiàn)大量的腫瘤細(xì)胞血管管型,并在管型中發(fā)現(xiàn)大量紅細(xì)胞;將NSCLC患者的肺部腫物組織HE染色也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞圍成的血管樣結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)論：
　　 細(xì)胞病理學(xué)和組織病理