FMNL2、RhoC、PRL3在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控關(guān)系.pdf

1、一、研究背景以及研究目的
　　 結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因之一，闡明結(jié)直腸癌的分子轉(zhuǎn)移機(jī)制以及控制腫瘤轉(zhuǎn)移成為當(dāng)前的主要研究方向;同時(shí)尋找結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記，為藥物作用靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　 最近Formins家族蛋白作為細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組建和裝配的關(guān)鍵調(diào)控分子引起人們的廣泛關(guān)注，F(xiàn)MNL2是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)Diaphano

2、us相關(guān)的formins(DRFs)亞家族成員，在前期實(shí)驗(yàn)中，我們通過基因芯片生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)FMNL2與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能作為一個(gè)研究結(jié)直腸癌侵襲以及轉(zhuǎn)移新的潛在靶點(diǎn)。隨后的實(shí)驗(yàn)證明FMNL2在結(jié)直腸癌中與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與癌組織的浸潤(rùn)深度、分化、腫瘤的位置無關(guān)，可能是通過影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。朱曦齡博士沉默F(xiàn)MNL2基因后，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、侵襲及體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移能力都受到抑制，同時(shí)與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)的Rh

3、oA/ROCK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)均降低，認(rèn)為FMNL2參與Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;隨后Kitzing等應(yīng)用siRNA技術(shù)屏蔽15種人Formin因子，發(fā)現(xiàn)FMNL2是選擇性的與有活性的RhoC反應(yīng)，則認(rèn)為FMNL2是RhoC的下游靶效應(yīng)子。
　　 肝再生磷酸酶3(PRL3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和遷移的蛋白酪氨酸磷酸酶，屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族成員。近年來研究發(fā)現(xiàn)，它與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其引發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移和

4、增強(qiáng)浸潤(rùn)能力的作用機(jī)制尚不明確。Fiordalisi等研究體外結(jié)直腸癌細(xì)胞系SW480，發(fā)現(xiàn)PRL3高表達(dá)能夠引起結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株小GTP酶活性改變，其中RhoA和RhoC表達(dá)增加4至5倍，Rac活性降低70％左右，對(duì)Cdc42沒有影響，表明Rho家族蛋白是PRL3相關(guān)信號(hào)通路的下游元件。
　　 綜上所述，F(xiàn)MNL2、RhoC以及PRL3在腫瘤組織高表達(dá)，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，涉及腫瘤轉(zhuǎn)移過程多個(gè)方面。綜合文獻(xiàn)FMNL2和R

5、ho蛋白之間存在怎樣的調(diào)控關(guān)系？FMNL2參與Rho細(xì)胞運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路的哪個(gè)作用環(huán)節(jié)？FMNL2和PRL3蛋白之間是否存在調(diào)控關(guān)系？FMNL2與哪些靶蛋白發(fā)生相互作用？以上問題尚不清楚。
　　 二、研究目的
　　 本研究在此基礎(chǔ)上以RhoC-FMNL2路徑為主線，驗(yàn)證FMNL2參與結(jié)直腸癌Rho細(xì)胞運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路，確定FMNL2在通路中的作用環(huán)節(jié)和關(guān)鍵作用蛋白，同時(shí)我們認(rèn)為FMNL2也參與PRL3調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)，通過探討PRL

6、3、RhoC、FMNL2三者關(guān)系可能涉及的相關(guān)信號(hào)通路，揭示FMNL2參與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)和靶向治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.FMNL2、RhoC和PRL3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及相互作用關(guān)系
　　 1.1結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本及組織芯片制作
　　 標(biāo)本收集:70例結(jié)直腸癌標(biāo)本選自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院病理科檔案石蠟組織塊，具有完整的臨床資料，本研究結(jié)直腸癌組織70例（

7、包括發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的31例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例;高中分化的62例，低分化的8例），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌31例（取自手術(shù)切除標(biāo)本所附的淋巴結(jié)），其中男41例，女29例，年齡在23-83歲之間，中位年齡53歲。組織芯片制作:取樣前對(duì)蠟塊的切片作鏡下形態(tài)學(xué)觀察選取有典型組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)的區(qū)域，并在蠟塊確定取樣部位，使用組織微陣列儀在每個(gè)蠟塊穿取組織芯，每個(gè)組織蠟塊取3個(gè)孔，點(diǎn)樣直徑約1mm，制成的組織芯片備用。實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)移組31例和非轉(zhuǎn)移組39例，轉(zhuǎn)移

8、組取原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)癌組織;非轉(zhuǎn)移組僅取原發(fā)灶癌組織。
　　 1.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　 組織芯片切片厚度5um，常規(guī)脫蠟脫水、抗原經(jīng)高壓鍋熱修復(fù)、封閉，常規(guī)HE染色，免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)染色應(yīng)用SP法，PRL3抗體、RhoC抗體(1∶100)、FMNL2抗體(1∶75)，操作步驟按試劑說明書進(jìn)行，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。
　　 2 FMNL2沉默后結(jié)直腸癌細(xì)胞系中RhoC、PRL3表達(dá)變化
　

9、　 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW620/FMNL2↓和SW620均為本實(shí)驗(yàn)室自存，SW620屬于FMNL2高表達(dá)細(xì)胞株，來自結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶;SW620/FMNL2↓為前期實(shí)驗(yàn)基因沉默F(xiàn)MNL2表達(dá)的SW620細(xì)胞株。在37℃5％CO2條件下，培養(yǎng)于含5％胎牛牛血清的DMEM中，每周傳代2～3次，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
　　 2.2免疫組化檢測(cè)不同結(jié)直腸癌細(xì)胞中RhoC、PRL3表達(dá)變化

10、r>　　 按照免疫組化試劑盒操作，首先制作細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛固定20min，PRL3抗體、RhoC抗體（1∶100稀釋）作為一抗，4°過夜孵育，蘇木素復(fù)染，PBS液取代一抗作陰性對(duì)照。
　　 2.3應(yīng)用Westblot檢測(cè)FMNL2沉默后結(jié)直腸癌細(xì)胞系中RhoC、PRL3蛋白表達(dá)變化。
　　 收集結(jié)直腸癌細(xì)胞后提取蛋白，用12％SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，PVDF膜用5％脫脂奶粉進(jìn)行封閉，加入兔抗人R

11、hoC、PRL3（1∶150稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗膜5min×3次，加入二抗(1∶5000稀釋)的HRP標(biāo)記室溫孵育1h，洗膜后經(jīng)化學(xué)發(fā)光自顯影成像，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。
　　 2.4 Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)變化
　　 提取總RNA1μg為模版，以oligo dT為引物，37℃反應(yīng)15min，85℃5s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此cDNA鏈2μg為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過相對(duì)

12、定量熒光定量 PCR檢測(cè)， RhoC引物序列上游5'-ATGCGTGCAATCCGAAAGAAG-3';下游5'-TCAGAGAATGGGACAGCCCCT-3'，PRL3上游引物為5'-AGGACGCCATCCAGTTCATC-3'，下游引物為5'-AGGTGAGCTGCTTGCTGTTA-3';以GAPDH為內(nèi)參，PCR反應(yīng)條件為:95℃30s;95℃，5s;60℃34s;40個(gè)循環(huán)后，應(yīng)用ABI PRISM7500 Fast Re

13、al-TimePCR擴(kuò)增儀檢測(cè)各模板的Ct值，熒光信號(hào)檢測(cè)。定量方法:以Folds=2-△△Ct表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系，實(shí)驗(yàn)組為SW620/FMNL2↓細(xì)胞株，對(duì)照組為SW620細(xì)胞株;公式如下:△△Ct=(Ct(targetgene)-Ct(GAPDH))實(shí)驗(yàn)組-(Ct(target gene)-Ct(GAPDH))對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)

14、分析，免疫組化結(jié)果在OLYMPUS雙目顯微鏡高倍鏡(×400)下觀察，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算著色細(xì)胞比，判斷結(jié)果:無著色細(xì)胞或陽性細(xì)胞≤5％為陰性（-/+），陽性細(xì)胞6％-30％為中度陽性(++)，陽性細(xì)胞31％-100％為強(qiáng)陽性(+++);結(jié)直腸癌細(xì)胞株使用Image-Pro Plus6.0病理圖像分析軟件計(jì)算出陽性細(xì)胞平均光密度（AOD值），實(shí)驗(yàn)結(jié)果用中位數(shù)(Median，M)表示;所有結(jié)果均以mean±SD表示，臨床病理

15、特征分組統(tǒng)計(jì)采用Mann-whitney U檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 四、結(jié)果
　　 1、FMNL2、RhoC及PRL3在結(jié)直腸癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)情況。
　　 免疫組化結(jié)果顯示，陽性表達(dá)均位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，呈棕黃色或棕褐色顆粒，在正常結(jié)直腸粘膜中呈陰性或弱陽性，在結(jié)直腸癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織

16、中出現(xiàn)中強(qiáng)陽性表達(dá)。PRL3、RhoC及FMNL2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中陽性表達(dá)率均明顯高于結(jié)直腸癌組織（P＜0.01）。在不同類型結(jié)直腸癌組織中可見，三者在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中表達(dá)明顯比未伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組增強(qiáng)，差異有具有顯著性（P＜0.01)，但陽性表達(dá)與病人的年齡、性別、腫瘤細(xì)胞分化程度無相關(guān)性（P＞0.05）。通過比較三種蛋白在同一病例原發(fā)癌的表達(dá)，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，RhoC與PRL3表達(dá)有相關(guān)性(r=0.355)，RhoC與FMNL2表達(dá)也存在

17、有相關(guān)性(r=0.414)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 2、細(xì)胞免疫組化結(jié)果
　　 PRL3、RhoC陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒，均定位于細(xì)胞質(zhì)。測(cè)量陽性細(xì)胞強(qiáng)弱用平均光密度(AOD)表示，RhoC蛋白在SW620細(xì)胞、SW620/FMNL2↓細(xì)胞中AOD值分別為0.2411±0.0157、0.1245±0.0128，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.487，P＜0.05);而PRL-3蛋白的AOD值分別為0.224

18、9±0.02543，0.1773±0.05608(P＞0.05)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、Westblot檢測(cè)結(jié)果
　　 以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，結(jié)果顯示SW620/FMNL2↓細(xì)胞與β-actin灰度值比值為0.820±0.033，明顯低于SW620細(xì)胞組1.214±0.060(P＜0.05)，F(xiàn)MNL-2表達(dá)沉默后，RhoC蛋白表達(dá)明顯下降;PRL3蛋白表達(dá)在SW620細(xì)胞以及SW620/FMNL2↓細(xì)胞中與

19、β-actin灰度值比值分別為0.835±0.061;0.686±0.018組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082＞0.05)。
　　 4、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示均有擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線均進(jìn)入平臺(tái)期，溶解曲線未見雜峰，顯示擴(kuò)增為非特異性序列。通過公式計(jì)算發(fā)現(xiàn)，SW620細(xì)胞株為對(duì)照組，SW620/FMNL2↓細(xì)胞中RhoC mRNA的表達(dá)水平是SW620的0.618倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義