人肝臟特異性O(shè)ATP-C分子保守區(qū)陽離子氨基酸在硫酸鹽雌酮轉(zhuǎn)運中的作用.pdf

1、背景與目的：我們知道，肝臟是維持人體正常機能的重要器官，其主要功能之一是從門靜脈血液中攝取一些毒性的有機化合物，在肝細(xì)胞中加工、轉(zhuǎn)化、代謝，再分泌到膽汁中，經(jīng)腸道隨糞便排出體外，從而防止毒性物質(zhì)在體內(nèi)的聚集，發(fā)揮其解毒作用。肝臟攝取有機化合物溶質(zhì)的功能在很大程度上主要由肝細(xì)胞膜上一組結(jié)構(gòu)和功能相似的轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)介導(dǎo)，即有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽OATPs(Organic anion transportingpolypeptides)[1]。OAT

2、Ps是由具有轉(zhuǎn)運有機陰離子底物特性的膜轉(zhuǎn)運蛋白組成的大家族，目前己發(fā)現(xiàn)在OATPs家族中，大鼠11種、小鼠8種和人的9種成員，廣泛分布于多種組織器官，如：肝、腦組織的血腦屏障和脈絡(luò)膜叢、肺、心、腸、腎、胎盤和睪丸。這類轉(zhuǎn)運蛋白的底物相當(dāng)廣泛，包括許多極性化的有機陰離子溶質(zhì)，如膽汁酸鹽、有機染料、固醇類鰲合物、甲狀腺激素、陰離子寡肽、許多藥物、抗生素類化合物、毒素等內(nèi)源性和外源性物質(zhì)。 OATP-C(SLC21A6)是人肝臟中特

3、異性表達(dá)的有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽，是OATPs(Organic anion transporting polypeptides)家族的重要成員，它分布在竇狀間隙肝細(xì)胞基底側(cè)膜上，參與肝臟攝取多種內(nèi)源性和外源性有機溶質(zhì)(如膽紅素、多種藥物和外源性有機毒素等)，是肝臟藥物代謝的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，OATP-C的底物非常廣泛，主要有：膽紅素及其葡萄糖甘酸、膽汁酸鹽[2]、硫酸鹽、多肽[2]及藥物(如多種他汀類降脂藥[阿伐他汀，西立伐他汀，氟伐地汀

4、，匹伐他汀，羅蘇伐他汀和辛伐他汀[3-8]]，內(nèi)皮素受體抑制劑阿曲生坦和波生坦[9-11]，抗生素青霉素G和利福平[12,13]，抗真菌藥卡泊芬凈[14]，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑依那普利、替莫普利[15，16]，血管緊張素II抑制劑奧美沙坦和纈沙坦[17，181等)，其中膽紅素及其葡萄糖甘酸是OATP-C的天然底物[19]，這也是OATPs家族中唯一能轉(zhuǎn)運膽紅素的成員。OATP-C在肝臟的特有分布及其底物的廣泛性表明OATP-C在肝臟攝

5、取藥物中有極其重要的作用。因此研究其轉(zhuǎn)運分子機制對于闡明藥物和毒素在肝臟的攝取轉(zhuǎn)運過程以及了解和認(rèn)識肝臟OATP-C參與的藥物代謝動力學(xué)、膽酸和膽紅素攝取轉(zhuǎn)運、肝臟解毒功能有重要的理論意義，對進(jìn)一步設(shè)計和篩選該轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑或增強劑用于臨床治療也具有重要的指導(dǎo)意義。 本研究源于我們從比較生物學(xué)的角度，發(fā)現(xiàn)起源于2億年前的一種古老的海洋魚類低等脊椎動物-多髦毛小“鰩”(Raja erinacea，or Skate)的肝臟中，存在

6、與高等哺乳動物鼠和人等相似的有機陰離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，并克隆得到了一個在其肝臟組織中特異性高表達(dá)的、原始的sOatp基因[20]。進(jìn)一步對比“鰩”肝臟特異的sOatp和人肝特異性的OATP-C分子的高同源性區(qū)域，結(jié)合其有機陰離子底物轉(zhuǎn)運特性，發(fā)現(xiàn)OATP-C分子的7個位點的陽離子氨基酸為高度保守的氨基酸(即49 lys(k)、57 arg(r)、58 arg(r)、115 his(h)、181 arg(r)、490 lys(k)、580 ar

7、g(r))。我們推測這些陽離子氨基酸基團與OATP-C分子有機陰離子底物攝取功能密切相關(guān)，可能是關(guān)鍵的氨基酸基團。為驗證此假說，我們從人肝臟mRNA中克隆得到OATP-C全長cDNA序列，DNA序列測定完全正確。通過定點突變技術(shù)將這些陽離子氨基酸分別突變?yōu)橹行园被?，并?gòu)建其C端的GFP融合蛋白的真核表達(dá)載體。我們將野生型和突變體氨基酸的GFP融合真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，實驗觀察野生型和突變體OATP-C基因的細(xì)胞膜

8、定位能力及其底物攝取功能變化，以期揭示OATP-C轉(zhuǎn)運多肽對有機陰離子底物的選擇性轉(zhuǎn)運的分子作用機制。 材料和方法: 我們前期克隆的pcDNA-OATP-C-GFP野生融合型基因真核表達(dá)質(zhì)粒(稱野生型，Wt)及其保守區(qū)的7個陽離子氨基酸突變體融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒(稱突變體，Mut1～Mut7)，經(jīng)過由大腸桿菌DHs。感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化、擴增以及純化，得到較大量的質(zhì)粒；然后將8個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入貼壁培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞后，在激

9、光共聚焦顯微鏡下觀察HEK293細(xì)胞膜上綠色熒光的表達(dá)情況，間接了解Wt、Mut1～Mut7在HEK293細(xì)胞膜的定位能力；迸一步將8個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，加入等量的OATP-C的底物[3H]硫酸鹽雌酮ES(Estrone sulfate)，分別測定其5分鐘的底物攝取量，進(jìn)行Wt和Mut1～Mut7對底物ES攝取量的比較；并將Wt和膜外區(qū)Mut1、Mut6質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，加入不同濃度的[3H]ES，測定三種質(zhì)粒對不同

10、濃度ES的攝取量，計算出三者對ES的攝取動力曲線，比較三者的Km、Vmax值。 結(jié)果: 1.Wt、Mut1～Mut7八個融合蛋白質(zhì)粒均經(jīng)過大腸桿菌DHs。感受態(tài)成功擴增，并用invitrogen公司的PureLinkTM Quick質(zhì)粒試劑盒純化，用分光光度計測定8個質(zhì)粒的OD值，計算出其濃度。 2.Wt、Mut1～Mut7八個融合蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，均發(fā)現(xiàn)在其細(xì)胞膜上有綠色

11、熒光表達(dá)，說明均有細(xì)胞膜定位能力；通過共聚焦顯微鏡對胞膜綠色熒光的灰度進(jìn)行比較(p值均大于0.05)，說明在轉(zhuǎn)染后的HEK293細(xì)胞膜上的綠色熒光灰度未見明顯差異，表明在膜上的八種融合蛋白表達(dá)量是沒有明顯差異的。 3.Wt、Mut1～Mut7八個融合蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，加入等量的[3H]硫酸鹽雌酮(ES)，經(jīng)過3H放射量測定，換算出各自5min的對底物ES的攝取量。結(jié)果表明：Mut1～Mut7融合蛋白與Wt相比，5m

12、in的底物攝取量均明顯減少，P值均<0.01。說明了7個突變體的對硫酸鹽雌酮攝取功能是明顯減弱的。 4.Wt和膜外區(qū)Mut1、Mut6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，加入不同濃度的[3H]硫酸鹽雌酮，測定三種質(zhì)粒對不同濃度的硫酸鹽雌酮的攝取量，計算出三者的對硫酸鹽雌酮攝取動力曲線：Wt: Km=0.260.03，Vmax=111.82,1；Mutl: Km=0.43+0,04，Vmax=50.5±2.6； Mut6: Km=1.20±

13、0.06，Vmax=88.7±5.9。(Km的單位為μM； Km的單位為pmol.mg.protein-1.5min-1)。Wt與Mut1比較，Km p=0.005，Vmax P=0.000；Wt與Mut6比較，Km P=0.000，Vmax P=0.003。從結(jié)果可以看出，膜外區(qū)Mutl、Mut6兩種融合蛋白與Wt相比，攝取硫酸鹽雌酮的Km值均增大，而Vmax值均減小，進(jìn)一步從底物攝取動力學(xué)角度證明了膜外區(qū)的Mut1、Mut6對硫酸鹽

14、雌酮的攝取能力是明顯減弱的。 結(jié)論: 從比較生物學(xué)的角度比對“鰩”肝臟特異的sOatp和人肝特異性的OATP-C分子的高同源性區(qū)域，結(jié)合其有機陰離子底物轉(zhuǎn)運特性，發(fā)現(xiàn)OATP-C分子的7個位點的氨基酸為高度保守的陽離子氨基酸(即49 lys(k)、57 arg(r)、58 arg(r)、115 his(h)、181 arg(r)、490 lys(k)、580 arg(r))。推測它們?yōu)镺ATP-C分子的重要功能氨基酸基團