SHH基因高甲基化在先天性肛門直腸畸形發(fā)病機(jī)制中的研究.pdf

1、先天性肛門直腸畸形(anorectal malformations，ARM)是小兒最常見的消化道重大畸形，是世界衛(wèi)生組織常規(guī)監(jiān)測(cè)的先天畸形之一，我國發(fā)病率約為2.81/10000。雖然通過外科手術(shù)治療能夠糾治形態(tài)上的畸形，但有相當(dāng)部分患兒，尤其是中、高位畸形患兒，術(shù)后仍然存在不同程度的排便功能障礙如便失禁、污糞、便秘等，發(fā)生率高，直接影響著患兒術(shù)后的生活質(zhì)量。由于先天性ARM發(fā)病因素多樣及病理改變復(fù)雜，其具體病因及胚胎形成機(jī)制至今尚未完

2、全闡明。目前普遍認(rèn)為可能在妊娠期，特別是在妊娠早期肛門直腸發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期受外界因素如病毒感染、化學(xué)物質(zhì)、環(huán)境及營養(yǎng)因素等干擾引起宮內(nèi)環(huán)境不良而導(dǎo)致發(fā)育異常。為進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制，本研究借助全因組甲基化芯片及生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)ARM患兒末端直腸組織全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究;并對(duì)胚胎發(fā)育分化密切相關(guān)基因SHH在ARM中的甲基化狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，旨在進(jìn)一步闡明表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在ARM發(fā)病中的可能作用，以求為尋找有效的預(yù)防

3、和治療手段提供理論依據(jù)。
　　第一部分先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸全基因組甲基化狀態(tài)
　　目的:利用全基因組甲基化芯片技術(shù)及生物信息學(xué)方法對(duì)先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸組織的全基因組甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，篩選差異甲基化位點(diǎn)及基因，以進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制。
　　方法:收集先天性肛門直腸畸形患兒（高位畸形5例，中位畸形5例，低位畸形10例）和非胃腸道畸形患兒（6例，均為我院診斷并行手術(shù)治療的肛瘺）的末端直腸組織。分組

4、原則:分為中高位組、低位組和對(duì)照組，將同組病例的組織標(biāo)本混合檢測(cè)一張芯片，力圖使組間差異最大而組內(nèi)差異最小。采用人類全基因組甲基化芯片(450K Infinium Methylation Bead Chip)對(duì)全基因組中大于450000的CpG島或CpG位點(diǎn)進(jìn)行差異甲基化分析。每個(gè)CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩個(gè)探針:甲基化和去甲基化探針。對(duì)所得差異基因甲基化位點(diǎn)進(jìn)行校正方法及差異分析。
　　結(jié)果:在先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸組織全基因組D

5、NA中共篩選出32731個(gè)差異甲基化位點(diǎn)，其中15141個(gè)發(fā)生低甲基化，17590個(gè)發(fā)生高甲基化。我們根據(jù)基因的功能不同，再進(jìn)一步增加限定條件后，發(fā)現(xiàn)部分發(fā)育分化相關(guān)基因高甲基化占有優(yōu)勢(shì)，如SHH、Wnt5a、Fgf10、Cdx1等
　　結(jié)論:先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸標(biāo)本全基因組中部分發(fā)育分化相關(guān)基因相對(duì)高甲基化占有優(yōu)勢(shì)，如Wnt5a、Fgf10、Cdx1等均處于高甲基化狀態(tài)。而與人類胚胎發(fā)育，尤其是肛門直腸和腸神經(jīng)系統(tǒng)(E

6、ntric nervous system，ENS)的發(fā)育密切相關(guān)的SHH基因亦處于高甲基化狀態(tài)。
　　第二部分先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸SHH基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)
　　目的：研究先天性肛門直腸畸形患兒末端直腸組織中發(fā)育分化密切相關(guān)基因SHH啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，并觀察其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)情況。
　　方法：選取20例肛門直腸畸形（高位5例，中位5例，低位10例）及6例非胃腸道畸形對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比研究;分為中

7、高位組、低位組和對(duì)照組。術(shù)中留取末端直腸組織，提取組織的DNA和RNA;實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timeRT-PCR)檢測(cè)SHH的mRNA表達(dá)水平。亞硫酸氫鈉-測(cè)序法檢測(cè)SHH啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，中高位組和低位組中SHH啟動(dòng)子區(qū)平均甲基化程度明顯增高（p值分別為0.0036和0.0087），轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)明顯減低(p分別為0.0065和0.0156);中高位組相對(duì)于低位組，SHH啟動(dòng)子區(qū)