PTC124治療彈性纖維假黃瘤的初步研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　彈性纖維假黃瘤(Pseudoxanthoma elasticum,PXE),是一種少見的常染色體遺傳性疾病,由16號染色體上的ABCC6基因突變引起的,主要累及彈性纖維和結(jié)締組織,造成彈力纖維降解及組織鈣化變硬,可侵犯人體多個器官和系統(tǒng),主要表現(xiàn)為皮膚、眼、心血管系統(tǒng)損害,發(fā)病率約為1:50000。迄今為止,共發(fā)現(xiàn)ABCC6基因突變近600個。無義突變(nonsense mutation)是指由于某個堿基的改

2、變,使代某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子,從而使肽鏈合成提前終止,肽鏈合成中斷。PXE患者中無義突變的比例近40％,其中R1141X占30%,是主要的致病原因之一,目前缺乏有效的治療手段。
　　PTC124(Ataluren),是PTCTherapeutics公司生產(chǎn)的小分子藥劑,主要通過降低核糖體對早熟終止密碼子(Premature Terminationcodon,PTC)的敏感性,或忽略早熟終止密碼子,從而實現(xiàn)對早熟終止密

3、碼子的通讀(Read-through)。目前PTC124已經(jīng)應(yīng)用在治療遺傳性疾病的臨床試驗中,其中囊性纖維化(Cystic Fibrosis)已經(jīng)進入III期臨床試驗。
　　本實驗通過體外研究,觀察PTC124對PXE患者早熟終止密碼子的通讀作用,為臨床治療提供新的思路和辦法。
　　研究方法:
　　1.體外實驗以人HEK293細胞為研究模型
　　在PCMV6-hABCC6-DDK質(zhì)粒中建立已知的7種不同的早熟終止

4、密碼子突變模型,轉(zhuǎn)染至HEK293細胞,PTC124處理72小時,免異熒光染色法和細胞內(nèi)ELISA法檢測早熟終止密碼子的通讀效率。
　　2.體內(nèi)實驗以斑馬魚為研究模型
　　R1141X是最常見的無義突變,占35%,根據(jù)R1141X早熟終止密碼子通讀后變化的氨基酸序列,在BS/SK-hABCC6質(zhì)粒中,構(gòu)建3種可能的錯義突變模型,生成相應(yīng)的mRNA,顯微注射入斑馬魚胚胎進行拯救分析實驗,觀察斑馬魚胚胎的存活率而分析各種錯義突變

5、的作用。
　　結(jié)果:
　　1.體外實驗以人HEK293細胞為研究模型實驗結(jié)果
　　①PTC124濃度在0-40umol/L時無細胞毒性。②對7種無義突變,PTC124可以提高早熟終止密碼子的通讀效率,濃度在5umol/L時通讀效率最高。③PTC124濃度在5umol/L時,R1164X and R1275X的通讀效率最高,<8%。④早熟終止密碼子的通讀效率不僅受藥物濃度影響,還受早熟終止密碼子后一位氨基酸序列影響,且當(dāng)

6、+1位置的序列為“C”時最高。
　　2.體內(nèi)實驗以斑馬魚為研究模型實驗結(jié)果
　?、僭缡旖K止密碼子通讀后3種可能的錯義突變模型,生成相應(yīng)的mRNA,可以使斑馬魚胚胎正常發(fā)育,存活率分別為WT90.6%,TGG73.4%,TGC92.5%,GGA84%,陽性對照組(注射morpholino、R1141X)存活率29%,陰性對照組(注射standard control morpholino)存活率88%,治療組與mopholino

7、對照組之間有顯著性差異(p<0.05)。②3種錯義突變模型之間和突變模型與陰性對照組,斑馬魚胚胎存活率無顯著性差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.PTC124可以提高早熟終止密碼子的通讀效率,濃度在5ug/mL時通讀效率最高;
　　2.早熟終止密碼子的通讀效率不僅受藥物濃度影響,還受早熟終止密碼子后一位氨基酸序列影響,且當(dāng)+1位置的序列為“C”時最高;
　　3.早熟終止密碼子通讀后3種可能的錯義突變,生成