噻唑烷化合物YFZ-22對(duì)A549細(xì)胞的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和研究目的：
　　肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的一類疾病，具有較高的發(fā)病率與死亡率，已經(jīng)成為癌癥致死的首要原因。目前肺癌的治療主要以化療為主，但是現(xiàn)有的肺癌治療的藥物往往毒副作用較大且易引起耐藥，因此，尋找高效、毒副作用較小又能有效地克服多藥耐藥的化療藥物對(duì)于肺癌的治療具有極其重要的意義。
　　近年來(lái)，隨著對(duì)噻唑烷化合物的研究發(fā)現(xiàn)其具有廣譜的生物活性，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化學(xué)、醫(yī)藥、生物學(xué)等諸多領(lǐng)域，能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的分化與

2、凋亡，在癌癥治療方面顯示出良好的應(yīng)用前景。如MMPT和DBPT能通過(guò)影響細(xì)胞周期以及誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的凋亡途徑來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。鑒于噻唑烷化合物在肺腺癌中表現(xiàn)出的抗腫瘤活性以及在非小細(xì)胞肺癌中的潛在應(yīng)用，選擇YFZ-22（一種新型的噻唑烷化合物）作為研究藥物，將其引入A549細(xì)胞中進(jìn)行抗腫瘤活性的檢測(cè)以及作用機(jī)制的初步研究，以期為肺癌的治療提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1．體內(nèi)抑瘤檢測(cè)：建立裸鼠肺癌的移植瘤模型，給藥

3、后觀察YF Z-22對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　2．分析YFZ-22對(duì)A549細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用：
　　― XTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；
　　―克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力。
　　3．YFZ-22對(duì)A549細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用：
　　―倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)；
　　―吉姆薩染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；
　　―Hoechst33258熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核的片段化；

4、>　　―Nucleosome ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　4．細(xì)胞周期檢測(cè)：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)YFZ-22對(duì)A549細(xì)胞周期的影響。
　　5．調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)及凋亡的基因p53、p21表達(dá)檢測(cè)：ELISA法檢測(cè)p53、p21蛋白表達(dá)。
　　6．細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH水平檢測(cè)：熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH水平。
　　7．細(xì)胞凋亡途徑檢測(cè)：
　　―Caspase酶活檢測(cè)試劑盒分析Caspase的酶

5、活變化；
　　― ELISA法檢測(cè)Caspase酶抑制劑對(duì)YFZ-22誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1．YFZ-22對(duì)體內(nèi)A549細(xì)胞增殖的影響表明：YFZ-22能顯著的抑制裸鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)，且抑制A549細(xì)胞的增殖具有明顯的時(shí)間依賴性，隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，其抑制率逐漸增大。
　　2．YFZ-22對(duì)A549細(xì)胞體外生長(zhǎng)的抑制作用：
　　―XTT實(shí)驗(yàn)表明，YFZ-22可以顯著抑制體外培養(yǎng)的A

6、549細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)，即呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，并且對(duì)正常細(xì)胞毒性較??；
　　―克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，一定濃度的YFZ-22能夠顯著抑制A549細(xì)胞的克隆形成能力。
　　3．YFZ-22誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：
　　―3.0μM的YFZ-22處理A549細(xì)胞48小時(shí)，倒置相差顯微鏡，吉姆薩染色以及Hoec hst33258熒光染色可以觀察到細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，體積變

7、小，變圓，細(xì)胞膜出芽發(fā)泡，細(xì)胞內(nèi)空泡化現(xiàn)象嚴(yán)重，大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞核固縮呈致密濃染，染色質(zhì)凝集且邊緣化，出現(xiàn)凋亡小體，處于凋亡的不同階段，呈現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學(xué)特征；
　　―Nucleosome ELISA試劑盒檢測(cè)核小體水平顯示，用3.0μM和6.0μM的YFZ-22分別處理 A549細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h，核小體水平顯著增加，表明YFZ-22能誘導(dǎo) A549細(xì)胞的凋亡，且具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性。
　　4．

8、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期的檢測(cè)表明：用3.0μM的YFZ-22分別處理A549細(xì)胞6h、12h、24h后，引起A549細(xì)胞G2/M期阻滯。
　　5．P53、p21蛋白表達(dá)的檢測(cè)表明：YFZ-22上調(diào)了A549細(xì)胞內(nèi)p53、p21蛋白水平，且在一定時(shí)期內(nèi)具有時(shí)間依賴性。
　　6．細(xì)胞內(nèi) ROS、GSH水平檢測(cè)表明：與對(duì)照組相比，YFZ-22處理的A549細(xì)胞內(nèi) ROS水平有了顯著提高且具有劑量依賴性，GSH水平顯著降低，同樣具有劑

9、量依賴性。
　　7．YFZ-22誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡機(jī)制研究：Caspase酶活檢測(cè)以及Casp ase抑制劑對(duì)凋亡誘導(dǎo)的影響表明，YFZ-22能誘導(dǎo) A549細(xì)胞凋亡，其凋亡過(guò)程可能與線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1．YFZ-22能抑制體內(nèi)外A549細(xì)胞的增殖；
　　2．YFZ-22誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞的凋亡；
　　3．YFZ-22影響A549細(xì)胞的細(xì)胞周期，引起G2/M期阻滯；