銀杏葉多糖抗炎及抑制P-選擇素介導(dǎo)白細(xì)胞粘附作用研究.pdf

1、炎癥(inflammation)是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng),它包括致炎因子引起的損傷、機體防御性反應(yīng)和組織損傷恢復(fù)三個方面。適度的炎癥反應(yīng)是機體保護自我的一種免疫過程,而過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致機體的免疫損傷甚至危及生命。白細(xì)胞是機體的重要炎性細(xì)胞,其粘附并穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞向炎癥部位移行是炎癥的重要標(biāo)志,而白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的粘附分子與相應(yīng)配體的結(jié)合是炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的重要分子基礎(chǔ)。 選擇素(select

2、in)是細(xì)胞粘附分子的一個家族,主要功能是在炎癥發(fā)生時介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞,以及白細(xì)胞與白細(xì)胞或血小板之間的粘附。P-選擇素(P-selectin)是表達(dá)于活化血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的一種相對分子質(zhì)量約為140kDa的跨膜糖蛋白。它在炎癥過程的早期甚為重要,而在炎癥晚期則要同其他選擇素協(xié)同發(fā)揮作用。P-選擇素可通過與相應(yīng)配體PSL-1 (P-selectin glycoproteinligand-1)等的相互作用介導(dǎo)白細(xì)胞在活化血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動。因此,發(fā)現(xiàn)有效的P-選擇素配體類似物,尋找或合成具有影響P-選擇素表達(dá)及功能的藥物,將為炎癥發(fā)病機理的揭示及治療提供新的手段。 植物多糖是無毒的天然物質(zhì),具有較多生物活性。臨床研究表明,許多植物,如黃芪、香菇和枸杞等多糖都具有抗急性炎癥作用。但由于多糖的結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜,純化相對困難,因此影響了它們抗炎作用的深入研究。銀杏葉多糖(Polysaccharides ofGinkgo biloba leaf, PGBL

4、)是從銀杏葉中提取出來的一種活性成分。研究證明,PGBL具有明顯的抗炎活性,但其分子機理還不清楚,許多問題有待于進一步闡述。 本研究通過水煮、醇沉、干燥獲得了PGBL,經(jīng)進一步反復(fù)凍融、超濾和凝膠層析,截取了含量最多的級分,再經(jīng)透析、濃縮和干燥獲得了純化的PGBL (p-PGBL)。為搞清PGBL的抗炎作用,我們建立了小鼠急性腹腔炎癥模型,通過檢測小鼠耳腫脹度及觀察小鼠腹腔白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù),研究了p-PGBL 的抗炎效果。為

5、研究PGBL的抗炎機制,我們首先利用流式細(xì)胞儀,并通過P-選擇素及其阻斷性抗體9E1的標(biāo)記,檢測了p-PGBL對P-選擇素與其配體相互作用的影響。然后又以篩選出的穩(wěn)定表達(dá)P-選擇素的CHO細(xì)胞(CHO-P)作為P-選擇素的載體,采用體外模擬毛細(xì)血管真實生理狀態(tài)的層流實驗,對來自于人早幼粒白血病細(xì)胞系(HL-60細(xì)胞)和中性粒細(xì)胞的滾動和粘附進行檢測,觀察p-PGBL對它們的影響。為進一步探討PGBL的抗炎分子機制,我們分離了人臍靜脈內(nèi)皮

6、細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC),觀察了p-PGBL在流動條件下對中性粒細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的影響。 結(jié)果表明,p-PGBL為一白色粉末,易溶于水,比旋光度為[a]20D=+43,相對分子量約10 kD,多糖含量98.6％。進一步分析發(fā)現(xiàn),p-PGBL,組成為半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖醛酸,摩爾比為：6: 2.4: 1.7: 4.6:

7、 6.8: 1。在抗炎實驗中,我們發(fā)現(xiàn)p-PGBL 能抑制小鼠耳腫脹和腹腔中性粒細(xì)胞滲出,與PGBL的抑制效果相比差異不顯著,表明p-PGBL較好的保持了原有的抗炎活性。p-PGBL的抗炎作用與肝素相似,都能抑制小鼠腹腔中性粒細(xì)胞滲出。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,不同濃度的p-PGBL都對P-選擇素與HL-60細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的結(jié)合有抑制作用,提示PGBL的抗炎機理主要是充當(dāng)P-選擇素的配體類似物,阻斷P-選擇素與其配體的相互結(jié)合,抑制白細(xì)

8、胞的跨血管滲出。模擬毛細(xì)血管生理狀態(tài)的層流實驗結(jié)果表明,在層壁剪切力為1.0 dyn/cm2的條件下,三種不同濃度的p-PGBL可以明顯降低HL-60細(xì)胞及中性粒細(xì)胞在層流狀態(tài)下與CHO-P細(xì)胞的滾動和粘附,說明在接近生理流動條件下,p-PGBL可通過阻斷P-選擇素與其天然配體PSGL-1的相互作用,抑制中性粒細(xì)胞與活化血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。這個結(jié)果通過HUVEC的層流實驗得到進一步證實。另外,我們還發(fā)現(xiàn),P-選擇素阻斷性抗體(9E1)幾

9、乎完全阻斷中性粒細(xì)胞在CHO-P上的滾動,但僅部分阻斷在HUVEC上的滾動,表明在炎癥反應(yīng)過程中,除P-選擇素以外其它粘附分子或炎癥因子也參與了中性粒細(xì)胞的滾動。對于p-PGBL是如何參與阻斷其它粘附分子或炎癥因子的作用有待進一步研究。我們的實驗證明,PGBL有抗炎作用,其主要分子機制是通過有效阻斷P-選擇素與其配體的相互作用抑制中性粒細(xì)胞滲出。本研究不僅為深入闡明PGBL抑制白細(xì)胞粘附的抗炎分子機制,促進和發(fā)展多糖的抗粘附治療理論,篩