水飛薊素對CYP450代謝酶以及P-糖蛋白轉(zhuǎn)運體影響的研究.pdf

1、遺傳藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體活性的改變是導(dǎo)致臨床上藥物相互作用的主要機(jī)制，藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的遺傳多態(tài)性是藥物相互作用個體差異的重要決定因素。近年來，由于天然中草藥的使用越來越廣泛，天然植物藥與藥物的相互作用受到越來越多的重視，對遺傳藥理學(xué)的深入研究將有助于我們根據(jù)患者的遺傳特性來指導(dǎo)臨床上的中西藥合用，調(diào)整藥物的使用方法，以達(dá)到減少藥物不良反應(yīng)及確保藥物治療作用的目的。 細(xì)胞色素P450（CYP450）酶系由基因超家

2、族編碼的酶蛋白所組成，參與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。藥物對細(xì)胞色素P450酶活性的影響，是導(dǎo)致藥物相互作用的主要原因之一。細(xì)胞色素氧化酶CYP3A是一種重要的CYP450酶系，它在肝臟和腸道中含量豐富，占肝臟P450酶總量的25％，成人CYP3A主要有CYP3A4以及CYP3A5，臨床常用藥物的60％以上都通過CYP3A4和CYP3A5催化來完成氧化反應(yīng)。CYP3A的活性高低影響許多藥物的療效以及患者對藥物毒性的反應(yīng)，同時還影響

3、環(huán)境污染物致病的危險性。CYP3A表達(dá)增高可導(dǎo)致腫瘤化療的失敗。藥物對CYP3A活性的影響是導(dǎo)致藥物相互作用的主要原因之一。CYP3A基因表達(dá)存在顯著的個體差異，目前認(rèn)為，CYP3A5的基因突變是產(chǎn)生CYP3A酶活性差異的主要原因。CYP2C9酶是人類肝臟中重要的CYP2C亞家族同工酶，占人肝微粒體所有P450酶含量的20％左右，并代謝約10％的臨床常用藥物，如苯妥英，華法林，甲苯磺丁脲，格列吡嗪，格列本脲，托拉塞米，氯沙坦及許多非甾體

4、抗炎藥。CYP2C9基因具有遺傳多態(tài)性，導(dǎo)致CYP2C9酶活性存在差異，這是藥物代謝種族與個體差異的原因之一。具有功能意義的基因突變導(dǎo)致CYP2C9酶活性降低，可致使CYP2C9酶底物藥物療效下降或產(chǎn)生更多不良反應(yīng)。較多的體內(nèi)及體外試驗研究表明，CYP2C9*2和CYP2C9*3會改變CYP2C9酶對某些底物如華法令，苯妥英等的催化活性，其代謝能力均明顯降低。其中CYP2C9*3更為明顯。許多體內(nèi)體外研究表明，與野生型比較，CYP2C9

5、*3（Ile359Leu）對甲苯磺丁脲、華法林等多種CYP2C9底物氧化活性顯著下降，其結(jié)果是在體內(nèi)延長藥物的血漿消除半衰期，降低藥物的清除率；在體外增高米氏常數(shù)（Km）值，降低最大反應(yīng)速度（Vmax），酶活性顯著降低。因此，攜帶CYP2C9突變等位基因的個體可能會出現(xiàn)代謝不全從而發(fā)生中毒或降低藥物療效。 P-糖蛋白是由MDR1基因編碼的一種跨膜蛋白，是一種能量依賴型藥物外排泵，轉(zhuǎn)運大量結(jié)構(gòu)不同的化合物，通常是親脂性和兩歧性分子

6、的化合物。P-糖蛋白主要在肝臟和腸道及腎臟中表達(dá)，在藥物的吸收，組織分布和排泄方面發(fā)揮重要的作用。腸道的P-糖蛋白可主動將口服藥物泵出細(xì)胞外，抑制藥物的吸收，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而降低藥物療效。MDR1蛋白具有廣泛的組織分布和底物特異性，盡管P-糖蛋白最首先在腫瘤細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，后來觀察到它表達(dá)在許多正常組織，如腸，肝臟，腎，胰腺，腎上腺，P-糖蛋白在血腦屏障，脈絡(luò)叢也高表達(dá)，P-糖蛋白底物廣泛，包括環(huán)孢霉素A，泰素，地塞米松，利多卡因，

7、乙琥紅霉素和蛋白酶抑制劑等。 Silymarin（水飛薊素，益肝靈）是從菊科藥用植物水飛薊種子的種皮中提取出來的植物提取物，屬于黃酮類物質(zhì)，主要成分包括水飛薊賓（silybin）、異水飛薊賓（silydianin）、和silychristine等類黃酮物質(zhì)，由于silybin是其中的主要成分，所以計算silymarin摩爾濃度的時候，都是以silybin的分子量為基數(shù)進(jìn)行計算。黃酮類是一種廣泛存在于水果、蔬菜和植物飲料中的化合物

8、，在很多草藥中也含有黃酮類物質(zhì)。既往在美國人飲食中的研究表明，每天從食品中獲得的黃酮類物質(zhì)估計有1g左右，雖然此數(shù)據(jù)可能高估了攝取量。Silymarin一直以來被用于保護(hù)肝臟和用于肝臟疾病的輔助治療藥物，同時它還具有其他廣泛的作用，比如抗癌和預(yù)防胃潰瘍的發(fā)生，治療膽囊疾病、肝炎、肝硬化和黃疸它的護(hù)肝機(jī)理是通過阻礙有害毒素進(jìn)入和幫助從肝細(xì)胞去除這些物質(zhì)從而保護(hù)肝臟細(xì)胞。Silymarin一般最常用的用途為中和酒精對肝部的有害作用。組成si

9、lymarin的三種異構(gòu)體（中文名為：水飛薊賓，異水飛薊賓、水飛薊寧）中，水飛薊賓（silybin）具有最強(qiáng)的活性，并且很大程度上是水飛薊素所具有的特性的原因。臨床常用的silymarin劑量為：用于肝部疾病和肝功能損傷時，研究認(rèn)為應(yīng)每天服用420-600mg。對于患有慢性肝部疾病的患者，silymarin往往作為長期治療藥物使用，所以此藥物不可避免的與一些臨床上往往長期服用的常用藥物會發(fā)生合用現(xiàn)象。 過去的研究主要集中在該藥的

10、藥效研究領(lǐng)域，而對該藥的藥動學(xué)和藥物相互作用研究較少。藥物對細(xì)胞色素P450酶和藥物轉(zhuǎn)運體活性的影響，是導(dǎo)致藥物相互作用的主要原因之一。為了最大限度地減少因藥物相互作用而導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)，指導(dǎo)臨床合理用藥，研究已知藥物對細(xì)胞色素P450酶和藥物轉(zhuǎn)運體活性的影響具有重要的臨床意義。 基于以上研究背景，本課題旨在查明水飛薊素對幾種重要的CYP450酶和藥物轉(zhuǎn)運體在體外和人體內(nèi)產(chǎn)生的影響及其臨床意義。通過建立體外的細(xì)胞平臺，在mRN

11、A表達(dá)和蛋白表達(dá)水平層面探討水飛薊素對上述CYP450酶的影響；并進(jìn)一步通過嚴(yán)格設(shè)計的臨床實驗，分別以咪達(dá)唑侖、洛沙坦和他林洛爾為探藥，基于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運體的遺傳多態(tài)性對其功能的影響，在整體藥代動力學(xué)水平和藥物相互作用層面探討水飛薊素制劑對相應(yīng)CYP450酶和藥物轉(zhuǎn)運體活性的影響，為臨床上藥物相互作用及個體反應(yīng)差異提供分子水平的解釋，并為臨床實施中西藥合理運用和基因?qū)蛐詡€體化用藥提供指導(dǎo)。本課題的主要研究結(jié)果如下： 1.在C

12、hangLiver細(xì)胞系中觀察水飛薊素對CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP2E1mRNA和蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)水飛薊素對CYP3A4mRNA表達(dá)有明顯的抑制作用，水飛薊素處理ChangLiver細(xì)胞48小時能夠顯著減少CYP3A4mRNA含量，并且呈濃度依賴性，在水飛薊素處理24小時候也可以觀察到CYP3A4mRNA表達(dá)減少的趨勢，并且在40μM處理組此差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；水飛薊素對CYP2C9mRNA表達(dá)

13、也呈現(xiàn)顯著的抑制作用，水飛薊素處理ChangLiver細(xì)胞24小時和48小時均能夠使CYP2C9mRNA含量顯著減少，并且呈濃度依賴性，以48小時抑制作用表現(xiàn)更明顯。對于CYP2C19、CYP2D6以及CYP2E1，不同濃度的水飛薊素分別作用24和48小時則沒有表現(xiàn)出明顯的抑制或者誘導(dǎo)效應(yīng)。水飛薊素對CYP3A4和CYP2C9蛋白表達(dá)有明顯的抑制作用，水飛薊素處理ChangLiver細(xì)胞24小時和48小時均能夠顯著減少CYP3A4和CY

14、P2C9蛋白含量，并且呈濃度依賴性，且在48小時抑制作用表現(xiàn)更明顯。 2.以鎮(zhèn)靜安眠藥咪達(dá)唑侖作為探藥，在不同CYP3A5*3基因型個體中研究了水飛薊素對人體CYP3A酶代謝活性的影響，表明水飛薊素能夠抑制CYP3A所介導(dǎo)的咪達(dá)唑侖羥化代謝。 3.用洛沙坦作為探藥，研究了不同CYP2C9基因型個體中水飛薊素對洛沙坦及其活性代謝產(chǎn)物E3174藥代動力學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)洛沙坦轉(zhuǎn)化為E3174的代謝率在應(yīng)用水飛薊素后顯著降低，并且

15、洛沙坦和E3174的AUC（0-24），AUC（0-∞）和Cmax的變化程度在CYP2C9不同基因型間有顯著差異，表明水飛薊素對人體CYP2C9酶活性有顯著的抑制作用； 4.用他林洛爾作為探藥，在不同MDR1基因型個體研究了水飛薊素對人體P-糖蛋白轉(zhuǎn)運體活性的影響，發(fā)現(xiàn)水飛薊素顯著增加了他林洛爾的血藥濃度和口服利用度，提示水飛薊素在人體內(nèi)顯著抑制了P-糖蛋白轉(zhuǎn)運體活性； 總之，本項目從細(xì)胞到臨床整體水平為水飛薊素制劑的臨