藥物代謝酶CYP450基因熱點(diǎn)突變功能及檢測芯片的研究.pdf

1、細(xì)胞色素氧化酶P450(CYP450)是人體內(nèi)一類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的重要代謝酶，代謝活化許多種藥物、前致癌物、前毒物和致變劑。大約有60％的藥物主要是由依賴CYP450s的代謝作用清除的。在CYP450酶系中，CYP4501～3家族得到了廣泛而深入的研究，其功能和性質(zhì)的研究尤為引人關(guān)注。 第一部分中，針對CYP2D6基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)C188T和64268C，采用寡核苷酸芯片對240位健康志愿者基因組DNA標(biāo)本進(jìn)行了

2、分型檢測。將受試者的兩個(gè)位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型分型結(jié)果組合進(jìn)行分析，并且進(jìn)一步對CYP2D6芯片分型與藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行了闡述和討論。芯片分型結(jié)果表明，CYP2D6ch等位基因在中國人群中出現(xiàn)的頻率相當(dāng)高，C188T和G4268C純合突變型的比例分別達(dá)到了53％和54％，出現(xiàn)相應(yīng)等位基因CYP2D6ch的頻率與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果大體一致，并通過擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序驗(yàn)證了芯片的分型結(jié)果，兩者具有良好的一致性。在中國人

3、群中，CYP2D6酶確實(shí)有突變頻率較高的等位基因存在。 同時(shí)選取同一群體中40位志愿者按照芯片分型結(jié)果分成4組進(jìn)行藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)(以酒石酸美托洛爾為探藥)，采用高效液相色譜法檢測了受試者體內(nèi)血藥濃度和藥物代謝產(chǎn)物濃度。不同基因型志愿者體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，第2組志愿者(CYP2D6*2H*10W／*2M*IOW)的所有藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與第l組志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比均沒有顯著性差異(P>0．05)。第3組志

4、愿者(CYP2D6*2M*10H)與第1組志愿者(CYP2D6*2W*10W)相比較，美托洛爾tla延長33．8％，AUC0-32增加了90．3％，；而α一羥基美托洛爾的tl／2延長47．3％，AUCo-32降低了40．8％，C一降低了43．9％。尿中排出的代謝產(chǎn)物降低而原藥則有所增加，CLo、CLform分別為第l組志愿者的46．9％和38％，但T一和Cmax均無明顯變化。第4組志愿者(CYP2D6*2M*10M)與第1組志愿者(CY

5、P2D6*2W*10W)相比較差異更大，美托洛爾ti／2延長93％，AUCo-32增加了149％，Cmax增加了30．8％；而α一羥基美托洛爾的ti／2延長79．1％，AUCo-32降低了62．6％，C一降低了60．2％。可以看出，藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與基因分型結(jié)果預(yù)測的表型變化具有良好的一致性。 第二部分中，依據(jù)中國(或是亞裔)人群具有相對較高發(fā)生率和突變導(dǎo)致的功能變化已知的原則，選擇了其中CYPlA2，CYP2D6，CYP2

6、C19，CYP2C9和CYP3A4五個(gè)重要基因的8個(gè)多態(tài)性為研究對象?；诤怂峁滔嚯s交原理，設(shè)計(jì)制備出能同時(shí)檢測不同CYP450多態(tài)性位點(diǎn)的基因分型芯片，并針對芯片雜交反應(yīng)和雜交前PCR擴(kuò)增兩個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。通過對PCR組分如Mg2+濃度、引物加入量和上下游濃度比值等條件的優(yōu)化，來建立并完善兩重PCR體系，并在此基礎(chǔ)上成功建立了一個(gè)四重PCR體系；通過對探針的篩選，比較每組探針的信號比值獲得了特異性最好的八對野生型和突變型檢測探針；另外