腎移植術(shù)后HCMV早期監(jiān)測方法建立及臨床應(yīng)用價值研究.pdf

1、論文從以下幾個方面進(jìn)行論述：
　　 一、立題依據(jù)和目的
　　 同種異體腎移植是目前國際公認(rèn)的治療慢性腎功能衰竭（終末期）尿毒癥的最佳選擇，全球每年腎臟移植數(shù)量已逾數(shù)萬例。中國自20世紀(jì)60年代初開展該項工作以來，目前每年的腎臟移植數(shù)量約有6000～8000例，名列全球第二，僅次于美國。由于免疫抑制劑的發(fā)展和臨床移植水平的提高，我國腎移植近期效果已得到了顯著的改善。有關(guān)的資料表明，五年生存率大于90％，但是腎移植的遠(yuǎn)期效果

2、至今卻未能得以相應(yīng)的提高，移植腎的平均半壽期仍徘徊在7～10年。目前，威脅腎移植患者長期生存最主要的問題是藥物毒性、心血管疾病、病毒性感染、排斥反應(yīng)等。在臨床上，大量免疫抑制劑應(yīng)用所誘發(fā)的感染已成為器官移植患者感染和死亡的重要原因，其中人巨細(xì)胞病毒（HumanCytomegalovirus，HCMV）感染使免疫功能受到抑制，機體抵抗力過度下降，HCMV和免疫細(xì)胞相互作用，引起炎癥反應(yīng)、移植器官排斥反應(yīng)，出現(xiàn)多臟器功能衰竭，嚴(yán)重的HCMV

3、感染可造成移植腎功能喪失；HCMV還可引起間質(zhì)性肺炎，并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征，病情進(jìn)展迅猛、治療棘手、預(yù)后極差，是移植受者死亡的重要原因之一。國外報道，腎移植術(shù)后HCMV感染率為59％-79％，HCMV感染相關(guān)死亡人數(shù)占腎移植近期總死亡人數(shù)的2％。因此控制病毒的感染就能在一定程度上延長移植腎的存活時間，也就能提高病人的存活率，降低死亡率。
　　 臨床上早期診斷和預(yù)防HCMV感染具有重要的意義。近年來，實時熒光定量PCR(FQ-P

4、CR)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于病毒感染的檢測，特別是在巨細(xì)胞病毒感染的診斷方面發(fā)揮著重要作用。實時熒光定量PCR(FQ-PCR)技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、在線實時監(jiān)測，結(jié)果直觀的特點。動態(tài)檢測血和尿中HCMVDNA載量，可很好地反映機體內(nèi)HCMV病毒量，而且取材方便、無創(chuàng)、易于接受，因此該方法正在普及使用。
　　 標(biāo)本采集對FQ-PCR的結(jié)果影響較大，目前多采用血液標(biāo)本，也見晨尿標(biāo)本提取模板用于檢測的資料報道。為了提高HCM

5、VDNA的檢出率和檢測的敏感性，本研究對取自腎移植患者血液標(biāo)本、晨尿標(biāo)本與二次濃縮尿標(biāo)本進(jìn)行了對比研究，發(fā)現(xiàn)二次濃縮尿沉渣檢測HCMVDNA，敏感性更高，檢出時間更早，同時對腎移植術(shù)前、術(shù)后的HCMVDNA載量進(jìn)行了動態(tài)監(jiān)測，為臨床及時采取抗病毒治療提供了客觀依據(jù)，為提高移植腎存活率、延長存活時間奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、實驗方法
　　 1．研究對象：2007年1月至2009年12月在山東省千佛山醫(yī)院進(jìn)行腎移植手術(shù)并堅持隨

6、訪的165例患者，其中男98例，女67例，年齡14～64歲（平均44.3歲），其中尸體腎移植116例，親體腎移植49例，分別于腎移植術(shù)前、術(shù)后第2～8周每周1次、第9～24周每2周1次收集標(biāo)本。同時設(shè)健康人群100例作為正常對照組。其中男58例，女42例，年齡20～60歲（平均41歲）。
　　 2．標(biāo)本采集及制備方法：
　　 2.1原尿沉渣標(biāo)本制備：取1mL晨尿12000r/min離心5min獲取沉淀，為原尿沉渣試驗組；

7、
　　 2.2二次濃縮尿沉渣標(biāo)本制備：取晨尿5mL，2500r/min離心5min，棄上清液4mL，留離心管底部1mL再做12000r/min離心5min，取沉淀為二次濃縮標(biāo)本組；
　　 2.3空腹采血2mL、EDTA鈉抗凝并2000r/min離心5min，取血漿用于試驗。
　　 3．HCMV-DNA提取與檢測分析：原尿沉渣和二次濃縮尿沉渣及血漿均用FQ-PCR檢測試劑盒（廣州中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心產(chǎn)品）檢測分

8、析，按說明書操作。根據(jù)本實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)，拷貝數(shù)高于（包括）1.0×103拷貝/ml判為陽性。
　　 4．臨床干預(yù)治療：將原尿沉渣和/或二次濃縮尿、血標(biāo)本監(jiān)測HCMV-DNA陽性組進(jìn)行更昔洛韋(GCV)抗病毒干預(yù)，連續(xù)靜脈滴注4周。劑量嚴(yán)格按照藥物使用說明（湖北科益藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）計算，腎功能正常者劑量為5mg/kg，每12小時靜脈滴注2.5mg/kg；腎功能減退者，肌酐清除率(SCr)50～69mL/min時，每12小時靜

9、脈滴注2.5mg/kg；SCr25～49mL/min時，每24小時靜脈滴注2.5mg/kg；SCr10～24mL/min時，每24小時靜脈滴注1.25mg/kg；SCr＜10mL/min時，每周3次，每次1.25mg/kg，于血液透析后給予。治療過程中采用血和尿（原尿和二次濃縮尿）兩種標(biāo)本同時進(jìn)行病毒拷貝數(shù)的動態(tài)觀察，以了解病毒拷貝數(shù)與臨床癥狀之間的關(guān)系。
　　 三、結(jié)果
　　 1．正常對照組100例、腎移植患者165例

10、術(shù)前原尿沉渣、二次濃縮尿沉渣及血漿HCMV-DNA檢測結(jié)果為陰性（腎移植術(shù)前165份二次濃縮尿沉渣標(biāo)本中有兩例HCMVDNA拷貝數(shù)低于1.0×103拷貝/ml）。
　　 2．腎移植術(shù)后HCMV-DNA在不同標(biāo)本檢測率的比較證實在腎移植術(shù)后165例患者中，原尿沉渣組有42例檢測到HCMV-DNA，檢出率25.45％；64例患者二次濃縮尿沉渣中檢測到HCMV-DNA，檢出率38.79％，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=6.727，p

11、＜0.01）；血漿有30例檢測到HCMV-DNA，檢出率18.18％，與二次濃縮尿組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=8.598，p＜0.01）；結(jié)果表明二次濃縮尿標(biāo)本檢出率高于原尿沉渣和血漿標(biāo)本。
　　 3．腎移植術(shù)后HCMV-DNA在不同標(biāo)本拷貝數(shù)的比較:165例患者中，采用二次濃縮尿標(biāo)本有64例檢出HCMV-DNA，DNA拷貝數(shù)為2.88×103～8.16×106拷貝/ml，平均拷貝數(shù)為1.07×106拷貝/ml；原尿沉渣標(biāo)本

12、有42份檢出HCMV-DNA，病毒拷貝數(shù)為1.00×103～6.16×106拷貝/ml，平均拷貝數(shù)為3.67×105拷貝/ml。將來自同一患者、相同采集時間的原尿沉渣組和二次濃縮尿沉渣組檢測結(jié)果進(jìn)行比較，病毒拷貝數(shù)原尿沉渣組低于二次濃縮尿沉渣組，經(jīng)配對資料秩和檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(U=4.772，p＜0.01)。原尿和二次濃縮尿不同數(shù)量級的檢出數(shù)之間比較，發(fā)現(xiàn)二次濃縮尿高數(shù)量級的例數(shù)較原尿組多。
　　 4．比較腎移植術(shù)后HCM

13、V-DNA檢出時間發(fā)現(xiàn)兩種標(biāo)本病毒DNA檢出高峰均出現(xiàn)于第6～8周，但二次濃縮尿術(shù)后第3周檢測到8例，而原尿沉渣檢出2例，分別占總檢出率的12.50％和4.86％；術(shù)后至第4周，原尿沉渣檢出8例，二次濃縮尿沉渣檢出17例，分別占19.00％和26.56％，表明二次濃縮尿檢出病毒DNA的時間早于原尿沉渣標(biāo)本。
　　 5．動態(tài)監(jiān)測臨床抗病毒干預(yù)過程中的HCMV-DNA顯示術(shù)后二次濃縮尿沉渣標(biāo)本與原尿沉渣標(biāo)本均檢測HCMV-DNA陽性

14、的64例患者進(jìn)行抗病毒干預(yù)后，采用原尿沉渣和二次濃縮尿沉渣方法進(jìn)行病毒DNA跟蹤監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)56例病毒基因拷貝數(shù)有顯著下降，并在1～2周后HCMV-DNA轉(zhuǎn)為陰性；有8例下降緩慢者出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為低熱、乏力、淋巴結(jié)腫大，咽喉疼痛，關(guān)節(jié)酸痛等，咳嗽，胸部CT診斷為間質(zhì)性肺炎，經(jīng)加強抗病毒及抗感染治療后臨床癥狀消失，HCMV-DNA轉(zhuǎn)為陰性。
　　 四、結(jié)論
　　 1．改進(jìn)標(biāo)本的采集和處理方法，即二次濃縮尿標(biāo)本，HCMVD