基于現(xiàn)代分離分析技術(shù)與活性篩選模型相結(jié)合的土茯苓藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、土茯苓Rhizoma Smilacis Glabrae為百合科植物土茯苓Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》附錄，是中醫(yī)臨床上的常用中藥之一。土茯苓味甘、淡、性平，具有清熱除濕，泄?jié)峤舛?，通利關(guān)節(jié)等功效，臨床上主要用于治療梅毒，泄瀉，淋濁，腳氣，筋骨攣痛，癰腫，瘰疬，瘡癬，癭瘤以及金屬汞中毒等，具有上千年的使用歷史。目前對于土茯苓的研究，大多局限于傳統(tǒng)的制劑研究，工藝優(yōu)化和藥理作用的發(fā)現(xiàn)，而對于深入

2、的研究，如采用先進(jìn)的提取技術(shù)手段對土茯苓進(jìn)行預(yù)處理、對其進(jìn)行深入的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和全面的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化過程研究等的報道較少。因此本研究在采用先進(jìn)的樣品前處理技術(shù)的基礎(chǔ)上，以多維色譜-組合質(zhì)譜法作為研究技術(shù)和手段，實現(xiàn)了土茯苓現(xiàn)代化提取、分離和鑒別并建立了單體的制備技術(shù)平臺，并對土茯苓體外質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確立和極性化合物組的藥效活性篩選進(jìn)行了深入的探討。本文首先采用單因素法優(yōu)化了加速溶劑萃取法（以下簡稱ASE）對土茯苓中的主要化學(xué)成分的提取條件

3、，利用高效液相色譜-組合質(zhì)譜技術(shù)鑒定出土茯苓中的多種化學(xué)成分;采用大孔吸附樹脂把土茯苓醇提取液切割為兩個不同極性化合物組，并用水提醇沉法得到土茯苓多糖組，在分別建立高尿酸血癥小鼠模型和鉛中毒wistar大鼠模型的基礎(chǔ)上，考察和篩選土茯苓上述化合物組降尿酸和促排鉛作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，再進(jìn)一步采用高速逆流法結(jié)合制備液相色譜技術(shù)對其中的活性單體進(jìn)行制備。在此基礎(chǔ)上，今后可以進(jìn)一步考察土茯苓提取液在wistar大鼠血漿和尿液的代謝譜，以考察土茯

4、苓在大鼠體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)化過程，推測可能的代謝途徑，從而為土茯苓的進(jìn)一步開發(fā)和利用，制備出療效好、毒性小的新型藥物奠定科學(xué)基礎(chǔ)。本文的研究內(nèi)容具體如下:
　　一、加速溶劑萃取法結(jié)合HPLC-PDA-ESI-ITMSn/TOF-MS技術(shù)建立土茯苓定性成分譜
　　本章首先對現(xiàn)代化萃取技術(shù)ASE法提取土茯苓中的有效成分進(jìn)行了全面的考察，通過單因素法考察了提取溫度、提取時間、提取溶劑、固液比、循環(huán)次數(shù)對土茯苓中化合物提取率的影響。研究

5、結(jié)果顯示，用ASE法，提取時間4min，在40℃的提取溫度為下，用20％乙醇為提取溶劑，固液比為0.5/10(g/ml)時1次循環(huán)就能實現(xiàn)對土茯苓藥材中的六種活性成分最大量的提取。進(jìn)一步與傳統(tǒng)的提取方法加熱回流法和超聲提取法進(jìn)行比較，采用文獻(xiàn)報道中的最優(yōu)化條件進(jìn)行活性成分的提取，發(fā)現(xiàn)ASE法具有萃取時間短、提取溫度低、有機溶劑量比例小和結(jié)果的重現(xiàn)性高的優(yōu)點。從而為土茯苓的提取又探索出一條新的綠色環(huán)保高效的途徑。在此基礎(chǔ)上，采用HPLC-

6、PDA-ESI-IT/MSn技術(shù)對土茯苓ASE法提取液中的化合物進(jìn)行分離和定性鑒別，對鑒別出的8種化合物采用UPLC-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的分子量的確認(rèn)，從而對文獻(xiàn)報道中某些色譜峰對應(yīng)的化合物相互矛盾的現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步的辨別，對土茯苓的體外質(zhì)量控制和作用機制研究提供了有力的保障。
　　二、土茯苓降血尿酸和排鉛作用的研究和活性化合物的制備
　　土茯苓具有清熱解毒，除濕通絡(luò)的功效，臨床上常用于高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療。土茯苓

7、解毒排重金屬早有記載，近年來，人們開始研究以土茯苓為主藥的中藥復(fù)方和制劑對鉛的促排作用。盡管如此，土茯苓排鉛和降尿酸的作用物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。本章首先將土茯苓醇提取物通過大孔吸附樹脂分離切割成兩部分，土茯苓大極性化合物組和土茯苓中極性化合物組，并運用加熱回流水提醇沉法制備出土茯苓多糖化合物組。
　　然后建立高尿酸血癥的小鼠模型，以別嘌呤醇作為陽性對照藥，對土茯苓各極性化合物組進(jìn)行降血尿酸實驗研究，篩選降血尿酸的土茯苓有效化合物組。結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)，土茯苓中極性化合物組具有良好的降血尿酸活性，中極性化合物組與陽性對照組之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(P＞0.05)。通過測定各組小鼠的肝臟黃嘌呤氧化酶的活性(XOD)，發(fā)現(xiàn)土茯苓中極性化合物組和陽性對照組小鼠肝臟的XOD相比于模型組均有所下降(P＜0.05)，兩組之間也沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異(P＞0.05)。另外，腎臟尿酸的測定結(jié)果與XOD的測定結(jié)果相似。上述結(jié)果表明土茯苓中極性化合物組是降低小鼠血尿酸的活性化合物組，其作用機制與別嘌呤類

9、似均是通過抑制XOD活力以此來抑制尿酸的生成而實現(xiàn)的。
　　另外建立wistar大鼠慢性鉛中毒模型，以二巰基丁二酸(DMSA)為陽性對照藥，對土茯苓各極性化合物組和多糖組進(jìn)行排鉛實驗研究，通過測定給藥前后染鉛大鼠血鉛、尿鉛和心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦和股骨中的鉛含量，篩選出促進(jìn)大鼠體內(nèi)鉛排出的土茯苓有效化合物組。研究發(fā)現(xiàn)，用藥21天后，與用藥前相比，各用藥組大鼠體內(nèi)的血鉛含量，心臟、肝臟、脾臟和腎臟內(nèi)的鉛含量均有所下降，且各器官內(nèi)

10、的鉛含量用藥前后相比均有極顯著性差異(P＜0.01);另外，除了陽性對照組外，中極性化合物組能降低大鼠腦部的鉛含量，大極性化合物組和中極性化合物組能降低大鼠股骨內(nèi)的鉛含量;且各組用藥前后相比在統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性的差異(P＜0.05)。
　　在藥效活性篩選的基礎(chǔ)上，對土茯苓中極性化合物組采用分析型高速逆流色譜技術(shù)結(jié)合制各液相色譜法制備出4個活性單體，即落新婦苷(astilbin)，異落新婦苷(isoastilbin)，新落新婦苷(n

11、eoastilbin)和新異落新婦苷(isoneoastilbin)。從而建立了基于藥效試驗的土茯苓活性單體的規(guī)模化制備的多維切割-高速逆流色譜分離-制備液相色譜純化分析技術(shù)平臺。
　　三、結(jié)合模式識別建立土茯苓體外指紋圖譜和多組分質(zhì)量控制
　　土茯苓藥材植物來源廣泛，不同產(chǎn)地的產(chǎn)品化學(xué)成分的差異很大，嚴(yán)重影響臨床療效，至今沒有統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和多組分定量依據(jù)。本章采用現(xiàn)代化的提取技術(shù)ASE法和分離分析技術(shù)HPLC法，建立了來

12、自全國不同生產(chǎn)地區(qū)不同批次的16批土茯苓樣品的高效液相指紋圖譜，并結(jié)合模式識別法對它們進(jìn)行了質(zhì)量評估。首先采用聚類分析把16批樣品分成兩組，4批歸為合格樣品組，12批歸為不合格樣品組。再用相似度分析軟件對12批合格樣品進(jìn)行分析，用相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行計算，結(jié)果顯示這12批合格樣品表現(xiàn)出相似的色譜模式，能夠準(zhǔn)確地反映出土茯苓樣品的實際質(zhì)量狀況。再將16批土茯苓樣品的典型HPLC色譜圖用中心尺度化的主成分法分析法進(jìn)行分析，所得的得分圖的結(jié)果與聚類

13、分析一致，從得到的載荷圖中確定了一些用于區(qū)分土茯苓質(zhì)量的變量即化合物，將其中能夠獲得對照品的6個黃酮類化合物作為定量指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，對12批合格土茯苓樣品進(jìn)行定量分析，以全面的評價土茯苓的品質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同批次的土茯苓樣品中6個黃酮類化合物的含量相差很大。因此，多組分定量測定土茯苓中活性化合物的含量對質(zhì)量控制具有重要意義。經(jīng)典的中藥指紋圖譜與模式識別法相結(jié)合可全面的評價中藥質(zhì)量，并為選擇定量指標(biāo)提供了依據(jù)。
　　綜上所述，本課