重組2型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)錳超氧化物歧化酶高表達(dá)對耳蝸血管紋緣細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分、耳蝸血管紋緣細(xì)胞氧化性損傷體外模型的建立 目的: 建立耳蝸血管紋緣細(xì)胞(Marginal cells，MCs)氧化性損傷的體外模型。 方法: 體外培養(yǎng)的耳蝸血管紋緣細(xì)胞中加入不同濃度的過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測200、300、400、600、800umol/L H2O2

2、作用0.5、1、2、4、16、24h對血管紋緣細(xì)胞活性的影響；檢測不同濃度H2O2作用2h血管紋緣細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(Malondial—dehyde，MDA)含量的變化；應(yīng)用碘化丙錠(Propidium Iodide，PI)染色流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的凋亡率；采用免疫印跡法（Western blot）檢測凋亡因子Caspase-3活化片段Cleaved-caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果: H2O2作用后血管紋緣細(xì)胞出現(xiàn)核固縮

3、、邊緣化,胞漿濃縮,被膜包裹,隆起,產(chǎn)生凋亡；隨著H2O2濃度的增加、H2O2作用時間的延長，緣細(xì)胞活性降低；200umol/L的H2O2作用2h，即可誘導(dǎo)緣細(xì)胞凋亡率升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cleaved-caspase-3在正常緣細(xì)胞呈微弱表達(dá)，H2O2作用后Cleaved-caspase-3表達(dá)明顯增強，并隨H2O2濃度的增高而增強，600umol/L組表達(dá)開始減弱，800umol/L僅見弱表達(dá)。 結(jié)論:

4、H2O2可復(fù)制耳蝸血管紋緣細(xì)胞的氧化性損傷，成功建立緣細(xì)胞氧化性損傷的體外模型，Caspase-3的激活參與了緣細(xì)胞的氧化損傷過程。 第二部分、重組2型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)錳超氧化物歧化酶轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞的研究 目的:　探討以重組2型腺相關(guān)病毒(Recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2，rAAV2)為載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠耳蝸血管紋緣細(xì)胞（Margi

5、nal cells，MCs），獲得高表達(dá)錳超氧化物歧化酶（Manganese Superoxide Dismutase，MnSOD）轉(zhuǎn)基因緣細(xì)胞的可行性。 方法:　實驗組按感染復(fù)數(shù)(MOI)為104v.g./cell對體外培養(yǎng)的血管紋緣細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV2- MnSOD-EGFP，同時設(shè)轉(zhuǎn)染rAAV2-EGFP的緣細(xì)胞作為空載對照組，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞為空白對照組。熒光顯微鏡下每2d觀察1次MCs的綠色熒光蛋白（Enhenced gree

6、n fluorescent protein，EGFP）表達(dá)情況。比色法測定各組MCs的MnSOD活性。激光共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染rAAV2- MnSOD-EGFP后MnSOD的表達(dá)，免疫印跡法（Western blot）半定量分析MnSOD的表達(dá)水平。 結(jié)果:　(1) 各組MCs轉(zhuǎn)染后，生長正常?？蛰d對照組MCs轉(zhuǎn)染rAAV2-EGFP后2天開始出現(xiàn)微弱EGFP的表達(dá)，1周后至高峰；實驗組轉(zhuǎn)染rAAV2-MnSOD-EGFP后4

7、d出現(xiàn)EGFP的表達(dá)，10d至高峰；且持續(xù)細(xì)胞體外生長的整個周期。EGFP的表達(dá)在熒光顯微鏡490nm波長激發(fā)光下呈黃綠色，彌漫于整個胞質(zhì)。(2)根據(jù)激光共聚焦顯微鏡及Western blot檢測結(jié)果、經(jīng)過計算，實驗組較空載對照組和空白對照組的MCs中MnSOD的表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論:　rAAV2-MnSOD-EGFP能有效地轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的MCs并持續(xù)高表達(dá)MnSOD。 第三部分、重組2型腺相關(guān)病毒介導(dǎo)

8、錳超氧化物歧化酶高表達(dá)對耳蝸血管紋緣細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 目的:　探討以重組2型腺相關(guān)病毒（Recombinant adeno-associated viruses of the serotypes 2，AAV2)介導(dǎo)錳超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase，MnSOD)高表達(dá)對耳蝸血管紋緣細(xì)胞氧化損傷的作用及機(jī)制。 方法:　體外培養(yǎng)血管紋緣細(xì)胞，分為實驗組、對照組及正常組。實驗組

9、按感染復(fù)數(shù)(MOI)為104v.g./cell轉(zhuǎn)染rAAV2-MnSOD-EGFP，同時轉(zhuǎn)染rAAV2-EGFP作對照組及不作處理緣細(xì)胞為正常組。熒光顯微鏡下觀察MCs綠色熒光蛋白（Enhenced green fluorescent protein，EGFP）的表達(dá)情況及免疫印跡法（Western blot）分析轉(zhuǎn)染后MnSOD的表達(dá)水平。實驗組及對照組同時暴露于400umol/L過氧化氫(Hydrogen peroxide H2O2

10、) 2h，24h后比色法測定各組丙二醛（Malondialdehyde，MDA)含量；流式細(xì)胞PI熒光標(biāo)記檢測細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測凋亡因子caspase-3活化片段Cleaved caspase-3的表達(dá)。 結(jié)果:(1) 各組MCs轉(zhuǎn)染后,生長正常,實驗組轉(zhuǎn)染rAAV2-MnSOD-EGFP后4d出現(xiàn)EGFP的表達(dá)，10d至高峰；且持續(xù)細(xì)胞體外生長的整個周期。實驗組MnSOD的表達(dá)及活性明顯高與對照組及正常組