中藥小復(fù)方“松友飲”通過調(diào)控肝星狀細(xì)胞抑制有纖維化背景肝癌的惡性潛能.pdf

1、肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱肝癌），是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，且具很高復(fù)發(fā)率和死亡率。由于其侵襲性強(qiáng)和發(fā)展迅速，大多數(shù)肝癌患者在確診時(shí)已近晚期，失去了手術(shù)根治機(jī)會(huì)。因此，超過70％的肝癌需要接受非根治性的治療方法，如肝動(dòng)脈栓塞化療、索拉非尼治療或系統(tǒng)性化療，但收效甚微。尤為甚者，在我國肝癌多合并肝纖維化、肝硬化背景。研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化、肝硬化、肝癌都是

2、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與肝間質(zhì)細(xì)胞相互作用的結(jié)果，這其中星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，作為肝間質(zhì)細(xì)胞的主要組成，與炎癥關(guān)系密切，受多種因素刺激，增殖活化，表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)并大量合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，成為肝纖維化等慢性肝病細(xì)胞外基質(zhì)和膠原產(chǎn)生的主要細(xì)胞來源，被認(rèn)為是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。而伴隨著HSC的激活、增殖

3、，肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MFB)的形成，以及與ECM共同構(gòu)成的組織微環(huán)境可能促成了肝干細(xì)胞或肝細(xì)胞向肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并在肝癌的進(jìn)一步增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。如此，肝癌細(xì)胞和星狀細(xì)胞間一定存在著密切的聯(lián)系，而這種聯(lián)系也許可成為肝癌治療的又一靶點(diǎn)，即通過調(diào)節(jié)肝癌微環(huán)境中的星狀細(xì)胞進(jìn)而抑制肝癌。
　　中醫(yī)藥抗纖維化和腫瘤治療歷史悠久，為我們發(fā)展有中國特色的抗肝癌研究提供了一條可探索之路。依托前人的經(jīng)驗(yàn)和前期的

4、研究基礎(chǔ)，我們應(yīng)用本所研制的含黃芪、丹參、山楂、鱉甲、枸杞五味成份的中藥小復(fù)方“松友飲”，對(duì)有肝纖維化背景的裸鼠原位移植瘤施以干預(yù)，并重點(diǎn)通過研究其對(duì)于肝癌纖維化微環(huán)境中的星狀細(xì)胞的作用，最終找到“松友飲”抑制有肝纖維化背景肝癌惡性潛能的可能機(jī)制。
　　目的:應(yīng)用中藥小復(fù)方“松友飲”(SYY)對(duì)有肝纖維化背景荷人肝癌裸鼠進(jìn)行干預(yù)，試圖證明“松友飲”通過對(duì)肝纖維化微環(huán)境中的肝星狀細(xì)胞(HSC)發(fā)揮影響而抑制肝癌的惡性潛能，并進(jìn)一步探

5、索其可能的作用機(jī)制。
　　方法:1、5-6周齡裸鼠30只，皮下注射四氯化碳(四氯化碳/橄欖油:50∶50)，每周一次，每只裸鼠5μl/g，自注射第四周末開始，每隔兩周頸椎脫臼法處死6只裸鼠，共計(jì)10周，動(dòng)態(tài)觀察肝臟大體標(biāo)本變化，利用組織病理切片和免疫組化技術(shù)，對(duì)裸鼠纖維化程度進(jìn)行鑒定。2、20只裸鼠隨機(jī)平均分為4組，原位接種高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞HCCLM3皮下瘤組織塊，原位種瘤后3天，其中兩組開始予以四氯化碳皮下注射（5μ l/g/只

6、/周），另外兩組予以同等劑量的生理鹽水處理，同時(shí)，在上述兩種處理方法下各有一組開始自由飲用SYY（2g/Kg/日），6周后全部裸鼠脫頸處死，觀察肝臟變化及成瘤情況，提取肝組織作病理檢查;5-6周齡裸鼠45只，隨機(jī)均分為9組，4組作為實(shí)驗(yàn)組，4組作為對(duì)照組，1組作為觀察組，實(shí)驗(yàn)組每組裸鼠皮下分別注射不同數(shù)量級(jí)的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞HCCLM3(0.1ml)和人肝星狀細(xì)胞LX2(0.1ml，1×105)的混合細(xì)胞共計(jì)0.2ml，對(duì)照組每組皮下注

7、射相應(yīng)數(shù)量級(jí)的HCCLM3細(xì)胞(0.2ml)而不混合LX2，最后1組在皮下單獨(dú)注射LX2細(xì)胞2×105(0.2ml)，12周后全部裸鼠脫頸處死，觀察皮下成瘤情況;5-6周齡裸鼠15只，隨機(jī)平均分成3組，取兩組，每只裸鼠皮下注射1×106LX2(0.1ml)和1×105HCCLM3(0.1ml)的混合細(xì)胞，其中一組作為實(shí)驗(yàn)組開始自由飲用SYY（2g/Kg/日），另一組作為對(duì)照組正常飲食，第三組裸鼠皮下注射1×106(0.2ml) LX2細(xì)

8、胞，正常飲食，6周后所有裸鼠脫頸處死，觀察皮下成瘤、肺轉(zhuǎn)移，提取肝、肺組織作病理檢查。3、利用CCK8實(shí)驗(yàn)和乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)(LDH)檢測(cè)“松友飲”對(duì)LX2的增殖抑制和毒性作用;取濃度(8mg/ml)SYY加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)LX2細(xì)胞48h，取其上清作為條件培養(yǎng)基再分別培養(yǎng)HCCLM3、Hep3B細(xì)胞，并以此作為實(shí)驗(yàn)組，兩組細(xì)胞的對(duì)照組則采用正常培養(yǎng)LX2培養(yǎng)基上清作為條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)，再取加入了同樣濃度的SYY的正常培養(yǎng)基培

9、養(yǎng)上述兩種細(xì)胞，同樣設(shè)立正常培養(yǎng)基作為對(duì)照組，以上各組細(xì)胞再分別進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK8實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn);抽提經(jīng)SYY處理過48h的LX2細(xì)胞的總RNA作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)狀態(tài)下的LX2細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行全基因組表達(dá)譜芯片分析，得到差異基因中的核心調(diào)控基因及與之相關(guān)的信號(hào)通路;利用蛋白免疫印跡(Western-blot)對(duì)核心基因編碼的蛋白及調(diào)控該信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行驗(yàn)證;利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Elisa)

10、對(duì)兩組細(xì)胞分泌上清中的相關(guān)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。4、應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、應(yīng)用四氯化碳皮下間斷注射法成功建立裸鼠肝纖維化模型;免疫組化顯示作為肝纖維化過程中心環(huán)節(jié)的星狀細(xì)胞，其活化階段的標(biāo)志性蛋白“α-SMA”的表達(dá)強(qiáng)度與肝纖維化進(jìn)展正相關(guān)。2、四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維背景下的肝癌瘤重大于正常肝臟背景下的原位移植瘤，每日自由飲用2g/Kg劑量的SYY對(duì)于肝纖維化背景下裸鼠的肝癌生長

11、有明顯抑制作用，同樣劑量的SYY對(duì)于正常肝臟背景下的肝癌生長無明顯抑制作用，免疫組化（α-SMA染色）提示:肝纖維化背景下的裸鼠肝癌及癌周存在大量活化的星狀細(xì)胞;細(xì)胞數(shù)量小于1×105的HCCLM3腫瘤細(xì)胞不能單獨(dú)皮下成瘤，細(xì)胞數(shù)量小于1×105的HCCLM3腫瘤細(xì)胞在混合了同樣數(shù)量的LX2細(xì)胞后，可以皮下成瘤，而相同數(shù)量的LX2細(xì)胞不能單獨(dú)成瘤;自由飲用SYY對(duì)于接種了HCCLM3和LX2混合細(xì)胞的裸鼠皮下瘤的生長有明顯抑制作用，單獨(dú)

12、接種同樣數(shù)量HCCLM3腫瘤細(xì)胞的裸鼠不能皮下成瘤，裸鼠混合皮下瘤組織切片HE和Sirius染色提示:兩組皮下瘤內(nèi)均存在大量的纖維細(xì)胞和膠原纖維組織，自由飲用SYY的裸鼠混合瘤組織內(nèi)細(xì)胞增殖核抗原(proliferatingcell nuclear antigen，PCNA)和α-SMA陽性染色累積光密度值均明顯小于對(duì)照組，兩組皮下瘤組織內(nèi)PCNA和a-SMA免疫熒光雙染也呈現(xiàn)同樣的結(jié)果，SYY對(duì)于裸鼠混合皮下瘤的肺轉(zhuǎn)移也有明顯抑制作用

13、。3、CCK8實(shí)驗(yàn)和乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)顯示“松友飲”(8mg/ml)對(duì)于人肝星狀細(xì)胞LX2沒有增殖抑制和急性毒性作用;經(jīng)SYY處理過LX2的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HCCLM3和Hep3B兩種腫瘤細(xì)胞均提示能夠減弱其克隆形成能力，并明顯弱化了兩種細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，而經(jīng)SYY直接處理的兩種腫瘤細(xì)胞在上述三個(gè)實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組相比較沒有明顯差異;全基因組芯片顯示，與對(duì)照組相比較，經(jīng)SYY處理過的LX2細(xì)胞中:上調(diào)的基因有1205個(gè)，下調(diào)的基因有1

14、323個(gè)，這其中與細(xì)胞增殖、凋亡、生長、分化相關(guān)的一些基因表達(dá)明顯下調(diào)（如:PIK3CD，AKT，IGF1R，TGF-β），并由此篩選出發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號(hào)通路PI3K/AKT; Western-blot結(jié)果證實(shí):經(jīng)SYY處理后的HSC，其細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路的一些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)明顯下調(diào);Elisa結(jié)果顯示:經(jīng)SYY處理后HSC所分泌的上清中，影響肝癌增殖，分化，侵襲的一些主要蛋白的表達(dá)受PI3K/AKT信號(hào)通路的下調(diào)明顯降

15、低。
　　結(jié)論:1、應(yīng)用四氯化碳皮下間斷注射法，可以成功建立實(shí)驗(yàn)性裸鼠肝纖維化動(dòng)物模型;2、肝纖維化過程中星狀細(xì)胞的活化程度與纖維化的進(jìn)展正相關(guān);3、“松友飲”(SYY)對(duì)于肝纖維化背景下肝癌的生長有明顯抑制作用;4、活化的星狀細(xì)胞(activated hepatic stellate cell，aHSC)與肝癌細(xì)胞混合接種對(duì)肝癌細(xì)胞的成瘤有明顯促進(jìn)作用;5、SYY對(duì)于aHSC和肝癌細(xì)胞混合皮下瘤的生長有抑制作用;6、SYY對(duì)aH