RASSF1A基因通過調(diào)控細胞凋亡、細胞周期和AKT-mTOR信號通路抑制黑色素瘤A375細胞的機制研究.pdf

1、RASSFlA是定位于腫瘤高頻雜合性丟失區(qū)域3p21.3位點的抑瘤基因，編碼一個微管相關(guān)蛋白。該基因在多種實體瘤組織中因啟動子高甲基化而表達沉默，是迄今為止在腫瘤組織中甲基化程度最高的基因之一。前期多項研究指出，除了在上皮性腫瘤中發(fā)生甲基化之外，RASSFlA基因在惡性黑色素瘤細胞中也存在高頻甲基化，提示該基因在黑色素瘤的發(fā)生過程中也可能存在表達異常。在本研究中，我們首次采用免疫組織化學(xué)及western blot的方法研究了RASSFl

2、A基因在正常皮膚組織、皮膚色素痣以及惡性黑色素瘤組織和細胞系中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RASSFlA蛋白在正常皮膚色素細胞和色素痣細胞中高表達，而在惡性黑色素瘤組織中表達下調(diào)甚至缺失，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。RASSFlA蛋白在非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系中有微弱表達，而在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系中表達缺失。該結(jié)果證實了RASSFlA在黑色素瘤組織和細胞中表達下調(diào)，強烈提示RASSFlA參與了黑色素瘤的發(fā)生與演進過程。
　　 以往關(guān)于RASSF

3、lA基因功能的研究絕大部分都是在上皮性腫瘤中開展的，為了進一步探討RASSFlA基因是否參與了惡黑的發(fā)生發(fā)展，我們在RASSFlA基因表達缺失的惡黑細胞系中轉(zhuǎn)染RASSFlA基因，恢復(fù)其表達，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，研究該基因?qū)汉诩毎飳W(xué)行為的影響。細胞生長曲線測定結(jié)果表明，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RASSFlA基因抑制了A375細胞的生長與增殖能力；平板集落形成實驗表明該基因同時抑制了A375細胞的克隆集落形成能力；進一步采用裸鼠移植瘤的方法證實，

4、穩(wěn)定表達RASSFlA基因不僅抑制了A375細胞的體外增殖能力，而且抑制了該細胞在裸鼠體內(nèi)形成移植瘤的能力。以上結(jié)果表明：RASSFlA基因具有抑制惡黑細胞生長增殖的能力，是一個黑色素瘤抑瘤基因。
　　 腫瘤細胞的生長與增殖受抑制，通常是通過影響細胞周期進程或者凋亡過程而實現(xiàn)。為了研究RASSFlA抑制惡黑的機制，我們對細胞周期及細胞凋亡進行了分析。}tochest33258染色發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達RASSFlA基因的A375細胞存在細

5、胞核固縮、濃染，是典型的細胞凋亡的形態(tài)；通過流式細胞儀檢測進一步證明，穩(wěn)定表達RASSFlA的A375細胞凋亡率增加；細胞周期進程分析結(jié)果表明，穩(wěn)定表達RASSFlA基因的A375細胞停留于G1期的細胞比例增加，而S期細胞比例降低，兩者相比具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明RASSFlA穩(wěn)定表達引起A375細胞周期G1.S期阻滯。Westem blot檢測發(fā)現(xiàn)RASSFlA抑制了cyclin D1和磷酸化Rb蛋白的表達；RASSFlA抑制cyclin

6、 D1蛋白表達是通過降低其蛋白穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明，RASSFlA是通過同時影響細胞凋亡與細胞周期而抑制惡黑細胞的增殖能力與致瘤性。
　　 為了研究RASSFlA基因穩(wěn)定表達對A375細胞基因表達譜的影響，采用Affimatrix公司全基因組表達譜芯片篩查受RASSFlA表達所調(diào)控的差異表達基因。篩選出受RASSFlA基因調(diào)控黑色素瘤A375細胞中差異表達的基因共210個，其中上調(diào)184個，下調(diào)26個基因。為了驗證基因芯片的數(shù)據(jù)

7、的可靠性，采用realtime RT-PCR方法檢測部分差異表達的基因，結(jié)果表明realtime RT-PCR檢測結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致，說明芯片數(shù)據(jù)可靠。通過生物信息學(xué)分析差異表達基因的功能歸類，發(fā)現(xiàn)RASSFlA調(diào)控的差異基因功能涉及轉(zhuǎn)錄與信號通路調(diào)控、細胞生長與增殖調(diào)控、細胞周期、細胞凋亡、細胞間粘附、細胞免疫應(yīng)答等過程，提示RASSFlA可能通過影響這些基因的表達從而影響A375細胞相應(yīng)的生物學(xué)過程。
　　 基因芯片篩查

8、發(fā)現(xiàn)RASSFlA基因穩(wěn)定表達引起細胞凋亡相關(guān)分子ASK1表達上調(diào)，結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)RASSF1 A穩(wěn)定表達促進A375細胞凋亡，我們認為RASSFlA可能是通過影響ASKl的表達從而促進惡黑細胞凋亡。通過realtime RT-PCR～lJwestem blot檢測證實RASSF1 A轉(zhuǎn)染后ASKl的表達水平上調(diào)。由于ASKl是JNK、P38 MAPK的上游激酶，我們采用western blot分析了JNK、P38 MAPK的表達，結(jié)果表

9、明磷酸化P38 MAPK表達增加，total P38 MAPK表達水平?jīng)]有改變；在RASSFlA轉(zhuǎn)染細胞和空載體對照細胞中，我們沒有檢測到磷酸化的JNK表達。說明RASSFlA引起ASKl表達上調(diào)促進了P38 MAPK的活化；western blot分析發(fā)現(xiàn)RASSFlA下調(diào)Bcl2表達，并引起cytochromeC從線粒體漏出至胞漿，促進了caspase3的表達與活化，說明RASSFlA通過活化P38 MAPK激活線粒體凋亡途徑，是其

10、促進細胞凋亡的分子機制。在RASSFlA穩(wěn)定表達的細胞中采用RNAi的方法抑制ASKl表達，結(jié)果細胞凋亡率下降，說明RASSFlA促進惡黑細胞凋亡的作用部分依賴于ASKl。
　　 RASSFlA抑制惡黑細胞增殖、促進凋亡的作用有可能是通過影響細胞信號傳導(dǎo)。采用westem blot分析與增殖、凋亡密切相關(guān)的細胞信號通路的表達與活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASSF1A抑制了AKT的磷酸化，并引起其下游mTOR通路的p70S6K與eIF4E磷酸

11、化水平降低，對其總蛋白表達沒有影響，表明RASSF1A抑制了A375細胞AKT/mTOR通路的活化。在RASSFlA穩(wěn)定表達的細胞中瞬時轉(zhuǎn)染myc-AKT1質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達AKT1可以逆轉(zhuǎn)RASSF1A對凋亡、細胞周期相關(guān)分子的調(diào)節(jié)，具體表現(xiàn)為：瞬時轉(zhuǎn)染分子myc.AKT1引起RASSF1A/A375細胞中磷酸化P38 MAPK表達下調(diào)，而磷酸化eIF4E、Bc12和cycling D1表達水平上調(diào)，說明過表達AKT1可以逆轉(zhuǎn)RAS