細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性檢測芯片的研發(fā)及在腎移植中的應(yīng)用.pdf

1、為了確定腎移植供者及受者的細(xì)胞因子及相應(yīng)受體單核苷酸多態(tài)性分布情況，研究腎移植供受者細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性對腎移植效果的影響；本研究通過整合細(xì)胞因子及其受體的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)并構(gòu)建寡核苷酸芯片，對2002年10月～2004年3月間上海市器官移植中心和南京軍區(qū)福州總醫(yī)院兩個(gè)中心129例首次尸體腎移植受者及相應(yīng)的99名供者，進(jìn)行細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性檢測和術(shù)后詳細(xì)隨訪，初步研究其對腎移植近期臨床效果的影響(急排和感染)。

2、 第一部分細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片的研發(fā)。 目的：構(gòu)建檢測細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β1及其受體單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的寡核苷酸芯片，建立器官移植中檢測細(xì)胞因子及受體基因多態(tài)性的方法學(xué)。 方法：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)、參照NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫和NCI的SNP500Cancer數(shù)據(jù)庫，選取臨床上有意義的細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，如IL-4(-590C/T，-33

3、C/T)，IL-4R(-3223C/T，Ile50ValA/G，1902A/G)，IL-6(-174G/C，-573G/C，-597G/A)，IL-6R(-183G/A，D358AA/C)，IL-10(-1087G/A，-824C/T，-597C/A)，IL-10R1(536A/G，1112G/A)，TNF-α(-308G/A，-238G/A)，TNFR2[Exon2(168)G/A，Exon6(587)G/T]，TGF-β1(+869

4、T/C)，TGFβR2[(codon389)1167C/T]，通過相應(yīng)序列，設(shè)計(jì)寡核苷酸探針58條，基因組DNA通過多重PCR擴(kuò)增，Cy5標(biāo)記。標(biāo)記后的產(chǎn)物與芯片上探針雜交，激光掃描，熒光信號值分析，判斷各位點(diǎn)的基因型，并通過測序驗(yàn)證。 結(jié)果：90份外周血樣，除10份因時(shí)間過久，沒有PCR產(chǎn)物外，余80份均檢測成功，三次重復(fù)檢驗(yàn)無差異，測序驗(yàn)證無位點(diǎn)錯(cuò)誤。 結(jié)論：寡核苷酸芯片技術(shù)檢測細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，具

5、有特異性高、敏感性高、重復(fù)性好、高通量、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的方法。 第二部分供、受者細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性對腎移植近期急性排斥反應(yīng)的影響。 目的：研究腎移植供受者的細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體單核苷酸多態(tài)性對術(shù)后早期急性移植物排斥的影響。 方法：(1)129名腎移植受者分成急性排斥組和無排斥組(6個(gè)月內(nèi))，根據(jù)HLA-A-B-DR錯(cuò)配、神經(jīng)鈣蛋白抑制劑、腎功能延遲恢復(fù)、ATG或MAb誘導(dǎo)治療、冷缺血

6、時(shí)間等情況，對兩組病人進(jìn)行比較，并比較兩組5種細(xì)胞因子及5種受體的21個(gè)位點(diǎn)的基因型分布情況。(2)根據(jù)HLA-DR配型情況分成0-1個(gè)HLADR位點(diǎn)錯(cuò)配組(0-1MM)、HLA-DR完全錯(cuò)配組(2MM)，比較兩組基因多態(tài)性的分布情況。(3)排斥組中根據(jù)激素敏感性分為激素敏感組和激素抵抗組進(jìn)行比較。 結(jié)論：(1)排斥易感因素分別為：受者基因型IL-4RIle50ValA/G、IL-4R1902AA、IL-10-1087AA、TN

7、F-α-238G/A、TNFR2Exon6(587)TT、TGF-β1+869TT；受者等位基因IL-6-174G、IL-10-824C、IL-10-597C、TNF-α-238A、TGF-β1+869T。供者基因型IL-4R-3223CC、IL-4RIle50ValAA、IL-6-597GG、IL-6-174G/C、IL-6R-183G/A、IL-6RD358AA/C、IL-10-1087AA、IL-10R11112GG、TGF-β1

8、+869T/C、TGFβR2codon3891167C/T；供者等位基因IL-4R-3223C、IL-6-597G、IL-10-597C、IL-10R11112G、TGFβR2codon3891167T。(2)HLA-DR完全錯(cuò)配情況下，供受者不同基因多態(tài)性對排斥有影響。受者IL-4R1902AA，IL-10-1087AA，TNFR2Exon6(587)TT；供者IL-4R-3223C，IL-6R-183G/A，IL-6RD358AA/

9、C，IL-10-1087AA，IL-10R11112GG；這些基因是獨(dú)立于HLA-DR錯(cuò)配之外的排斥易感基因，對預(yù)測排斥的發(fā)生有指導(dǎo)意義。(3)對激素抵抗性排斥來說，供受者不同基因多態(tài)性對排斥也有影響，供者雜合子IL-6-174G/C和TGF-β1+869T/C是激素抵抗性排斥外的獨(dú)立易感基因。 第三部分受者細(xì)胞因子及其受體單核苷酸多態(tài)性對腎移植近期感染事件的影響。 目的：觀察和分析腎移植受者細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體基因多

10、態(tài)性對腎移植術(shù)后發(fā)生感染的影響。 方法：(1)129名腎移植受者分成感染組和無感染組(6個(gè)月內(nèi))，比較可能影響腎移植后感染發(fā)生的因素在兩組病人中的分布情況，比較感染組和非感染組病人中5種細(xì)胞因子及5種受體的21個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布情況。(2)根據(jù)排斥反應(yīng)發(fā)生情況分成排斥感染組和無排斥感染組，以無排斥組為參照進(jìn)行兩組基因多態(tài)性分布比較。 結(jié)論：(1)基因型IL-6R-183GG、IL-10-824C/T、IL-10-59

11、7C/A、TNF-α-308GG；等位基因IL-4R1902A、IL-6R-183G、IL-10R11112G、TNF-α-308G、TGF-β1+869C是腎移植后感染的易感因素，尤基因型IL-6R-183GG、IL-10-824C/T、IL-10-597C/A；等位基因IL-4R1902A、IL-6R-183G、IL-10R11112G更具指導(dǎo)意義。(2)排斥因素成為術(shù)后感染的危險(xiǎn)因素，純合子IL-4-590TT、IL-4-33TT