糖尿病大鼠胃黏膜免疫異常與胃動力障礙關系及中藥作用.pdf

1、目的：通過研究血流干預藥物止血敏的凝血和蚓激酶的活血作用以及健脾活血中藥“糖胃康”對糖尿病運動障礙大鼠胃黏膜和黏膜免疫相關的神經、胃腸激素之間相互調節(jié)的影響，明確血流因素在糖尿病胃動力障礙發(fā)病機制中的作用以及神經內分泌免疫網絡在糖尿病胃動力障礙發(fā)病中的作用，闡明健脾活血代表方“糖胃康”對糖尿病胃動力障礙大鼠神經內分泌免疫網絡的影響。以揭示糖尿病胃動力障礙發(fā)病的內在機制，并部分明確中藥“糖胃康”治療糖尿病胃動力障礙的作用部位、環(huán)節(jié)及分子機

2、制，為中藥防治糖尿病胃動力障礙開辟新方法和理論依據，為臨床治療糖尿病胃動力障礙提供一個有效的中藥制劑。 材料方法：取SPF級131只SD雄性大鼠，體重160±20g，隨機分為兩組，其中正常組10只，造模組121只，所有動物禁食12h后，于次日清晨空腹狀態(tài)下測血糖，剔除血糖過高或偏離正常值較大的動物，稱重，一次性腹腔注射0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液鏈脲佐菌素(STZ)給造模組，注射劑量60mg/kg，正常對照組大鼠單次腹

3、腔注射等容量的0.1mol/L(pH4.5)檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，至造模后第7天起，所有實驗大鼠檢測血糖值，以血糖≥16.7mmol/L為造模成功。 將造模成功的大鼠按計算機隨機數字表隨機分為模型組、止血敏組(20只左右)、蚓激酶組(30只左右)和中藥(30只左右)組。造模成功后第3天起，中藥組大鼠予中藥，以1g/1ml的水煎劑灌胃；止血敏組大鼠予止血敏灌胃；蚓激酶組大鼠予蚓激酶腹腔注射；模型組和正常組大鼠予等量蒸餾水灌胃，以

4、上三組均每周組藥6次，周日不給藥。所給藥物劑量相當于成人臨床常用劑量2倍。 每天觀察并記錄動物一般狀態(tài)(包括飲食、排泄、分泌物、毛發(fā)、精神狀態(tài)、自主運動、眼白內障等、死亡等的變化)。每三周稱體重一次，按新體重重新計算給三藥的給藥藥量。于造模成功的第17周和第30周空腹測血糖一次，然后做胃排空實驗確定糖尿病胃輕癱大鼠模型成功建立。 第30周，從大鼠心臟采血，取血清測量胰島素、C肽，測定血脂四項和超過氧化物歧化酶(SOD)以

5、及丙二醛(MDA)，取血漿做血液流變學的檢測；處死大鼠取其胰島尾部進行中性甲醛固定后包埋、切片做蘇木素—伊紅染色(HE染色)及特殊染色—醛品紅-橙黃G染色，觀察胰島破壞情況；用幽門螺桿菌試紙(Hp)對胃竇黏膜進行檢測后，取胃竇分別進行中性甲醛固定、包埋、切片，做HE染色進行胃竇部黏膜、肌肉層、微血管病變和淋巴細胞的觀察，然后用甲苯胺藍染肥大細胞、Masson法觀察神經纖維，用免疫組化法檢測胃竇黏膜凋亡基因Bcl-2、Fas、炎性腫瘤壞死

6、因子-α(TNF-α)和白細胞介素1(IL-1β)以及神經遞質5-羥色胺(5-HT)、一氧化氮合酶(nNOS)和血管內皮細胞表面CD34，TUNEL法原位雜交檢測胃黏膜細胞凋亡；4％多聚甲醛固定胃竇、包埋、切片做胃腸激素P物質(SP)和血管活性肽(VIP)的免疫組化染色；戊二醛固定胃體組織，電鏡下觀察胃微血管及神經纖維的超微結構，同時取其胸腺和脾臟進行體重檢測。 結果：1糖尿病大鼠胃動力障礙模型建立及干預藥物影響的結果1.1體重

7、及胰腺胰島變化造模前各組體重無顯著性差異(P＞0.05)；造模后第3、6、9、12、15、18、21、24、27和30周時所有造模組(模型組、止血敏組、蚓激酶和中藥組)體重均明顯低于正常組(均有P＜0.01)，各造模組(模型組、止血敏組、蚓激酶和中藥組)之間體重均無顯著性差異(均有P＞0.05)。所有造模組胰腺胰島細胞均受到不同程度的損害，胰島細胞萎縮或排列紊亂，腺體腫脹，胰島β和a數量明顯減少，各藥物組之間相互比較均有明顯差異(P＜0

8、.05)。 1.2血糖及血清胰島素和C-肽的變化造模前各組大鼠血糖水平和體重無差異，造模7天后，正常組大鼠血糖均值為3.20mmol/L，造模組血糖≥16.7mmol/L的111只大鼠血糖在16.72-24.1mmol/L內，平均19.0±1.65mmol/L，符合實驗納入標準率為91.74％。實驗30周后，正常組大鼠血糖均值為2.90mmol/L、體重均值為523g、血清胰島素水平1176.75±204.71pmol/L、血清

9、C肽水平0.035±0.01pmol/L；模型組大鼠血糖均值為25.75mmol/L、體重均值為192g、血清胰島素水平392.08±125.91pmol/L、血清C肽水平0.070±0.024pmol/L；兩組大鼠相比，有顯著性差異(均有P＜0.05或P＜0.01)。 綜合上述各指標的變化表明糖尿病大鼠模型成功建立。經過胃排空試驗的檢測顯示所有造模組大鼠胃排空率顯著低于正常組(P＜0.01)，說明胃輕癱模型已經建立，藥物組之間

10、無明顯差異(P＞0.05)。 2血液流變學的變化及胃黏膜細胞凋亡的結果2.1血液流變學及血脂四項、SOD、MDA的檢測結果造模30周后，所有造模組(模型組、止血敏組、蚓激酶組和中藥組)血流變指標均有異常，全血黏度和血漿黏度、紅細胞壓積、還原黏度、紅細胞聚集指數均較正常組明顯升高，血沉較正常組加快，紅細胞變形指數增大，纖維蛋白原增加。 實驗30周后，正常組大鼠血清總膽固醇1.32±0.08mmol/L、血清甘油三酯0.60

11、±0.18mmol/L、血清高密度脂蛋白膽固醇0.51±0.11mmol/L、血清低密度脂蛋白膽固醇0.29±0.05mmol/L、血清超氧化物歧化酶活性392.22±11.48U/ml、血清丙二醛含量8.06±0.54mmol/ml；模型組大鼠血清總膽固醇5.88±0.33mmol/L、血清甘油三酯4.37±0.30mmol/L、血清高密度脂蛋白膽固醇0.10±0.05mmol/L、血清低密度脂蛋白膽固醇1.51±0.12mmol/L

12、、血清超氧化物歧化酶活性115.98±18.50U/ml、血清丙二醛含量17.23±1.03mmol/ml；止血敏組、蚓激酶組和中藥組的血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、超氧化歧化酶、丙二醛分別為5.38±0.36mmol/L、4.14±0.21mmol/L、0.22±0.09mmol/L、1.56±0.07mmol/L、93.86±18.18U/ml、17.45±0.64mmol/ml；5.22±0.21

13、mmol/L、3.76±0.41mmol/L、0.25±0.13mmol/L、1.52±0.11mmol/L、126.50±10.00U/ml、12.46±0.72mmol/L；4.39±0.48mmol/L、3.66±0.29mmol/L、0.31±0.07mmol/L、1.26±0.22mmol/L、247.46±21.47U/ml、10.24±0.43mmol/ml。與正常組比較差異顯著(P＜0.01)，與模型組和止血敏組相比，蚓