計(jì)算機(jī)輔助構(gòu)建組織工程肝臟仿生三維血管網(wǎng)絡(luò)的研究.pdf

1、第一部分骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和分化
　　 目的：探討小鼠骨髓源性間充干細(xì)胞(mesenchymal stem cells MSCs)體外培養(yǎng)、鑒定、分化的方法，研究間充質(zhì)干細(xì)胞在體外環(huán)境下向內(nèi)皮細(xì)胞分化的效率和功能變化。
　　 方法：分離小鼠股骨、脛骨，肝素抗凝，沖出骨髓，以Percoll密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法聯(lián)合分離、培養(yǎng)、純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。我們通過MTT法制備骨髓干細(xì)胞體外生長曲線。以CD2

2、9、CD90、CD105、CD34、CD415單克隆抗體通過流式細(xì)胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志。通過以地塞米松、胰島素等誘導(dǎo)P3代MSC向脂肪細(xì)胞分化，誘導(dǎo)后，以油紅染色鑒定分化的脂肪細(xì)胞。以VEGF誘導(dǎo)MSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化，以CD34、KDR等內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 結(jié)果：(1)密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離細(xì)胞，細(xì)胞接種12h后，可見有圓形或橢圓形細(xì)胞貼壁，72h后出現(xiàn)散在的紡錘狀貼壁細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)

3、10天后，出現(xiàn)致密的貼壁細(xì)胞層，此時(shí)細(xì)胞的兩極開始有規(guī)律地排列成束狀。(2)CD29、CD90、CD105流式檢測MSC表面標(biāo)志，陽性率均在90％以上。CD34、CD415則都低于8％。(3)骨髓干細(xì)胞P3向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后，加入油紅O染液顯示細(xì)胞內(nèi)有橙紅色脂肪滴呈現(xiàn)。(4)骨髓干細(xì)胞經(jīng)血管內(nèi)皮因子誘導(dǎo)誘導(dǎo)一周時(shí)，有散在的鵝卵石樣細(xì)胞出現(xiàn)。誘導(dǎo)兩周后，形成致密的貼壁細(xì)胞層，大部分細(xì)胞呈圓形或卵形形，細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列。CD34、KDR

4、陽性率分別為89.24±6.37％，85.19±4.52％。FITC-LIEA-1，DiI-acLDL雙染誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞陽性率為89.83±4.49％。同時(shí)，誘導(dǎo)后的內(nèi)皮細(xì)胞在體外保持良好的成管能力。
　　 結(jié)論：密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法可以在體外分離、培養(yǎng)出高純度骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，依舊具有多向分化潛能。
　　 第二部分可降解Poly(EC-CL)電紡膜的制備和表征
　　

5、 目的：以己內(nèi)酯和碳酸亞乙酯為原料合成可降解高分子聚合物聚己內(nèi)酯-碳酸亞乙酯Poly(EC-CL)，通過靜電紡技術(shù)制備納米Poly(EC-CL)電紡膜。
　　 方法：以甲苯為溶劑，通過稀土配合物Nd(DBMP)3催化碳酸亞乙酯和CL開環(huán)共聚合。NMR檢測聚合物化學(xué)結(jié)構(gòu)，F(xiàn)TIR傅里葉全反射紅外光譜分析聚合物中特征集團(tuán)的變化。以六氟異丙醇為溶劑，EC/CL共聚物比例為1:9，1:6，1:4的Poly(EC-CL)共聚物為原料，分別

6、制備不同濃度的電紡膜，通過掃描電鏡(SEM)觀察紡絲膜的纖維形貌。力學(xué)性能測試檢測各組電紡膜的拉伸強(qiáng)度、楊氏模量和斷裂伸長率。
　　 結(jié)果：從共聚物Poly(EC-CL)紅外圖譜證實(shí)聚合物為酯類聚合物，通過核磁共振圖譜沒有發(fā)生EC單體的均聚合和脫CO2副反應(yīng)發(fā)生，所得共聚物為無規(guī)共聚物。在poly(EC-CL)濃度為5％時(shí)，當(dāng)EC/CL從1:9上升到1:4時(shí)，纖維直徑從212±52nm上升到522±68nm，poly(EC-CL

7、)濃度為10％時(shí)，當(dāng)EC/CL從1:9上升到1:4時(shí)，纖維直徑從535±79nm上升到956±142nm，poly(EC-CL)濃度為15％時(shí)，EC/CL為1:9時(shí)，電紡膜纖維直徑為867±93nm，而EC/CL濃度為1:6和1:4時(shí)，不能形成有效電紡紡絲。力學(xué)性能測試發(fā)現(xiàn)隨著EC含量的增高，聚合物拉伸強(qiáng)度、屈服強(qiáng)度和楊氏模量逐漸下降，而斷裂伸長率隨EC含量增高而增大。
　　 結(jié)論：Poly(EC-CL)的濃度影響電紡纖維膜的形

8、態(tài)，Poly(EC-CL)是一種力學(xué)性能可調(diào)控的新型可降解高分子材料。
　　 第三部分Poly(EC-CL)/VEGF電紡膜片的制備及生物學(xué)性能檢測
　　 目的：以合成高分子材料Poly(EC-CL)和血管內(nèi)皮生長因子VEGF為原料，利用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建具有良好細(xì)胞相容性和機(jī)械性能的納米支架。
　　 方法：將VEGF與Poly(EC-CL)混合，配置成質(zhì)量比為0ng/g、10ng/g、100ng/g、1ug/g的

9、溶液，電壓15kV，流速2ml/h電紡納米纖維支架。掃描電鏡檢測電紡膜納米形態(tài)，細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Live/Dead細(xì)胞試劑盒檢測試驗(yàn)、細(xì)胞黏附試驗(yàn)、LDH釋放試驗(yàn)、間接接觸溶血試驗(yàn)、皮下植入試驗(yàn)檢測電紡膜細(xì)胞相容性和血液相容性。Poly(EC-CL)電紡膜誘導(dǎo)分化MSCs試驗(yàn)檢測電紡膜內(nèi)VEGF體外分化MSC的能力。
　　 結(jié)果：混合VEGF的poly(EC-CL)與純poly(EC-CL)聚合物膜片相比，纖維形態(tài)沒有分別，納米纖

10、維直徑在440±55nm，我們增加VEGF含量，纖維直徑?jīng)]有明顯變化(p>0.05)。細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Live/Dead細(xì)胞試劑盒檢測試驗(yàn)、細(xì)胞黏附試驗(yàn)證實(shí)Poly(EC-CL)/VEGF電紡膜具有良好的細(xì)胞性容性，VEGF/poly(EC-CL)(100ng/g；1μg/g)組上細(xì)胞明顯高于poly(EC-CL)和VEGF/poly(EC-CL)(10ng/g)(P<0.05)。間接接觸溶血試驗(yàn)各組溶血率均<6％，皮下植入試驗(yàn)?zāi)て闹苎?/p>

11、癥反應(yīng)輕微。當(dāng)VEGF含量>100ng/g時(shí)，可以有效誘導(dǎo)MSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　 結(jié)論：Poly(EC-CL)/VEGF共聚物具有良好的細(xì)胞相容性、組織相容性和血液相容性，能夠作為生物醫(yī)用植入材料。當(dāng)VEGF含量>100ng/g時(shí)，可以有效誘導(dǎo)MSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化。
　　 第四部分組織工程肝臟血管網(wǎng)絡(luò)的重建和檢測
　　 目的：完成仿生肝臟三維空間血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，明確這一組織工程實(shí)質(zhì)臟器三維血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建新方法

12、的可行性。
　　 方法：利用64排CT采集正常人肝臟血管并轉(zhuǎn)換成4cm×4cm血管斷層平面坐標(biāo)圖，根據(jù)血管不同斷面平面坐標(biāo)圖進(jìn)行激光打孔處理。SEM檢測打孔后，膜片變化。將打孔后的各膜片按次序通過基質(zhì)膠粘貼在一起。以GFP-腺病毒標(biāo)記骨髓干細(xì)胞誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞，將標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞灌注于仿生血管網(wǎng)絡(luò)中。放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3周檢測血管形成狀況。
　　 結(jié)果：激光打孔后，掃描電鏡觀察孔徑邊緣，孔徑邊緣光滑平