仿生酶促反應(yīng)抗血栓的組織工程血管構(gòu)建.pdf

1、隨著心血管疾病的發(fā)病率和死亡率不斷提高，臨床需要大量可用于移植小口徑的血管，目前臨床移植的血管主要包括自體血管與人工血管。自體血管移植過程中常面臨以下問題:一是數(shù)量有限，而且疾病狀態(tài)下自體血管質(zhì)量不高;二是取血管時(shí)會(huì)造成局部創(chuàng)傷。因此臨床迫切需要生物相容性好的人工血管，但是目前只有大口徑人工血管可以用于治療主動(dòng)脈病變等疾病，小口徑血管(＜6mm)常由于急性血栓形成造成較低的通暢率，導(dǎo)致移植的失敗。如何防止急性血栓形成是保證小口徑組織工程

2、血管通暢的關(guān)鍵問題。
　　組織工程血管作為外源異物，植入后血小板會(huì)粘附在暴露的膠原纖維上，此過程可逆而且會(huì)導(dǎo)致血小板活化并出現(xiàn)釋放反應(yīng)，釋放出的高濃度二磷酸腺苷(ADP)會(huì)導(dǎo)致血小板的不可逆聚集，聚集的血小板會(huì)進(jìn)一步激活凝血反應(yīng)，形成纖維蛋白網(wǎng)并網(wǎng)羅血細(xì)胞，形成穩(wěn)定血栓。因此抑制移植血管引起的血小板聚集是防止急性血栓形成的有效途徑。
　　目的:
　　還原氧化石墨烯(RGO)是一種有獨(dú)特物理化學(xué)性能的二維納米材料，擁有高

3、比表面積、高吸附性以及良好的穩(wěn)定性和生物相容性等優(yōu)良特性，目前被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究。生理情況下，內(nèi)皮細(xì)胞能夠不斷合成抗血小板和抗凝血的物質(zhì)從而防止血栓形成。受此啟發(fā)，設(shè)計(jì)了還原氧化石墨烯-酶(RGO-Enzyme)復(fù)合物修飾的仿生抗血栓小口徑組織工程血管。
　　以RGO為載體，將三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)與5'-核苷酸酶（5'-NT）通過共價(jià)鍵固定整合在其表面，不僅可以增強(qiáng)酶蛋白抗血流沖刷的穩(wěn)定性，而且能夠?yàn)閮煞N

4、酶提供級(jí)聯(lián)反應(yīng)的二維平臺(tái)。將RGO-Enzyme復(fù)合物修飾在血管基質(zhì)材料表面，制備得到抗血栓小口徑組織工程血管，兩種酶在生理?xiàng)l件下即可協(xié)同作用，催化血小板活化釋放的ADP不斷地轉(zhuǎn)化為腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)和腺苷[1]，降低了ADP濃度，而AMP與腺苷能夠減弱甚至逆轉(zhuǎn)由ADP引起的血小板聚集[10]，從而抑制了血栓形成。血小板的粘附但不聚集也有利于內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的募集、粘附以及分化[2，12]，同時(shí)由于腺苷能夠通過調(diào)控細(xì)胞能量

5、代謝優(yōu)化組織工程血管微環(huán)境，促進(jìn)了工程血管的快速內(nèi)皮化。血栓形成的抑制與內(nèi)皮化的促進(jìn)保證了組織工程血管的通暢。
　　方法:
　　1.RGO-Enzyme的合成與表征:在兩親性大分子DSPE-PEG2000-COOH的協(xié)助下使用超聲充分分散RGO，得到RGO分散液。在EDC和NHS的活化下，將Apyrase與5'-NT共價(jià)結(jié)合在RGO上的羧基端，得到RGO-Enzyme復(fù)合物。使用膠原包被的玻片作為模型，將RGO-Enzyme

6、復(fù)合物交聯(lián)在玻片表面后進(jìn)行平板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證RGO-Enzyme復(fù)合物抗血流沖刷剪切力的能力。使用透射電鏡(TEM)觀察RGO分散情況，使用拉曼光譜表征Enzyme在RGO表面的結(jié)合。
　　2.RGO-Enzyme酶活性的體外實(shí)驗(yàn):使用鉬酸鹽-孔雀石綠分光光度法在體外測(cè)定RGO-Enzyme的酶活性。使用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定在RGO-Enzyme的作用下血漿中ADP、AMP與腺苷含量的變化。獲取大鼠全血在體外驗(yàn)證RGO

7、-Enzyme的抗血小板團(tuán)聚性能，并使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)血液中的血小板活化程度進(jìn)行檢測(cè)。在體外驗(yàn)證RGO-Enzyme對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。
　　3.構(gòu)建RGO-Enzyme修飾的組織工程血管并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn):制備脫細(xì)胞組織工程血管基質(zhì)材料并將RGO-Enzyme修飾在表面，植入大鼠頸總動(dòng)脈后7天使用小動(dòng)物CT觀察血管通暢情況，并取出移植血管進(jìn)行掃描電子顯微鏡(SEM)觀察和切片HE染色。
　　結(jié)果:
　　1.TEM結(jié)果

8、表明RGO得到充分分散，從而增大了其比表面積和吸附性。拉曼光譜結(jié)果表明酶分子被成功交聯(lián)到RGO表面。平板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明RGO固定化的酶分子有更強(qiáng)的抗血流剪切力的作用，且不易發(fā)生團(tuán)聚。
　　2.酶活性測(cè)定以及HPLC結(jié)果表明RGO-Enzyme保持了較好的酶活性，能夠催化ADP轉(zhuǎn)變?yōu)锳MP與腺苷。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RGO-Enzyme能夠移植血小板的團(tuán)聚，減少血小板的活化，并且促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。
　　3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明R

9、GO-Enzyme修飾的組織工程血管在7天保持暢通，沒有形成血栓，且相比于對(duì)照組，其內(nèi)皮化程度更好。
　　結(jié)論:
　　使用RGO作為載體，構(gòu)建出整合了兩種酶的RGO-Enzyme協(xié)同納米催化體系，并將其修飾在組織工程血管基質(zhì)材料表面。在增強(qiáng)酶分子穩(wěn)定性的同時(shí)，將導(dǎo)致血小板聚集的最重要物質(zhì)ADP不斷的催化轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂锌寡“寰奂饔玫腁MP和調(diào)節(jié)局部微環(huán)境的腺苷，從而抑制血管移植引起的血小板團(tuán)聚和血栓形成，促進(jìn)內(nèi)皮化，保證組織工