人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療AT1-AA誘導(dǎo)的妊娠期高血壓疾病大鼠的潛能及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　 妊娠期高血壓疾病(HDCP)是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要疾病,其病因和確切的發(fā)病機(jī)理目前仍不清楚。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為子癇前期的發(fā)病與妊娠期間母體對(duì)于來(lái)自父系抗原的免疫適應(yīng)不良引起胎盤缺氧,胎盤細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力異常,螺旋動(dòng)脈重塑障礙、胎盤組織合成和釋放大量細(xì)胞因子進(jìn)入母體循環(huán)引起一氧化氮(nitricoxide,NO)活性下降,活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)增加、進(jìn)而導(dǎo)致腎臟功能

2、受損,外周阻力增加而引起高血壓。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)因具有免疫調(diào)節(jié)作用而起到維持免疫耐受的作用。異基因的胎兒被認(rèn)為是異基因的移植物,維持妊娠的相關(guān)耐受機(jī)制與移植耐受機(jī)制相似。
　　 目的:
　　 研究臍帶來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(HU-MSCs)對(duì)血管緊張素受體自身抗體誘導(dǎo)的妊娠期高血壓疾病模型大鼠的治療作用及機(jī)制,為HU-MSCs對(duì)妊娠期高血壓疾病的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)

3、。
　　 方法:
　　 1、建立酶消化法和組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)HU-MSCs,對(duì)細(xì)胞的一般形態(tài)、免疫表型進(jìn)行鑒定,應(yīng)用含綠色熒光蛋白的慢病毒(LV-GFP)轉(zhuǎn)染HU-MSCs,免疫組化方法檢測(cè)血紅素氧化酶1(hemeoxygenase1,HO-1)在HU-MSCs中的表達(dá)情況。
　　 2、大鼠源性的血管緊張素Ⅱ1型受體(AngiotensinⅡtype1Receptor,AT1R)第二胞外環(huán)的多肽片段偶聯(lián)血藍(lán)蛋白

4、(KLH)制備免疫原對(duì)大鼠進(jìn)行免疫16w,使用溴化氰活化瓊脂糖凝膠4B(Sepharose4BCNBr)親和純化血管緊張素受體自身抗體(AT1-AA),采用心肌跳動(dòng)頻率的變化鑒定所得的抗體,HE染色和PAS染色觀察腎臟的病理改變。
　　 3、大鼠妊娠12d和14d尾靜脈注射AT1-AA造成妊娠期高血壓疾病大鼠模型。AT1-AA注射半天后,將注射AT1-AA的妊娠大鼠隨機(jī)分成兩組:接受HU-MSCs的治療組(AT1-AA+MSCs

5、組,n=7)和未治療組(AT1-AA組,n=7)。對(duì)照組為在相應(yīng)妊娠天數(shù)注射0.9%生理鹽水的正常妊娠大鼠(NP組,n=6)。應(yīng)用免疫熒光切片技術(shù)檢測(cè)注射后的LV-GFP標(biāo)記的HU-MSCs在大鼠腎臟、胎盤和三角區(qū)以及胎鼠心臟、肺臟、腎臟和肝臟中的分布。妊娠第11、15和19d采用無(wú)創(chuàng)尾靜脈大鼠血壓儀檢測(cè)大鼠血壓。妊娠第20d處死大鼠,檢測(cè)HU-MSCs對(duì)胎鼠體重,胎鼠腎臟和肝臟發(fā)育情況,大鼠腎臟病理,螺旋動(dòng)脈重塑的影響,并且檢測(cè)腫瘤壞

6、死因子α(tumornecrosisα,TNF-α)、白介素10(intedeukin1O,IL-10)和HO-1因子的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、HU-MSCs呈現(xiàn)出成纖維樣的形態(tài)。應(yīng)用LV-GFP轉(zhuǎn)染HU-MSCs72h后轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上。流式細(xì)胞儀檢測(cè)HU-MSCs免疫表型,結(jié)果顯示各代細(xì)胞均表達(dá)CD73、CD90和CD105不表達(dá)表面標(biāo)記CD34、CD45、CD19,CD11和HLA-DR。HU-MSCs的

7、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在HO-1的強(qiáng)烈表達(dá)。
　　 2、應(yīng)用心肌細(xì)胞跳動(dòng)頻率檢測(cè)AT1-AA的活性表明,AT1-AA(1:50)能夠引起心肌跳動(dòng)頻率顯著增加(11.36±2.49bpm),氯沙坦(1.0～μmol/L)能夠阻斷AT1-AA引起的心肌跳動(dòng)頻率增加(1.29±1.77bpm＞,這說(shuō)明提取的AT1-AA具有活性。
　　 3、通過(guò)給予健康SD大鼠尾靜脈注射AT1-AA造模后,在妊娠第19d,AT1-AA組大鼠血壓較NP組顯著

8、升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AT1-AA組大鼠腎臟出現(xiàn)損傷、螺旋動(dòng)脈重塑障礙;.AT1-AA組胎鼠體重較NP組顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:AT1-AA組與NP組相比胎鼠腎臟、肝臟發(fā)育不良。
　　 4、通過(guò)HU-MSCs注射治療妊娠期高血壓疾病模型大鼠后,AT1-AA+MSCs組大鼠血壓較AT1-AA組顯著下降,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AT1-AA+MSCs組大鼠腎臟損傷較AT1-

9、AA組減輕,螺旋動(dòng)脈重塑障礙情況較AT1-AA組減輕;AT1-AA+MSCs組胎鼠體重較AT1-AA組顯著升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AT1-AA+MSCs組胎鼠腎臟、肝臟發(fā)育情況較AT1-AA組好轉(zhuǎn),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、通過(guò)對(duì)各組大鼠血清免疫因子TNF-α和IL-10的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)大鼠給予AT1-AA組促炎癥因子TNF-α較NP組比較有所升高,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

10、義,而抗炎癥因子IL-10卻下調(diào)了,與NP組比較其同樣具有統(tǒng)計(jì)意義。給予HU-MSCs注射的AT1-AA+MSCs組較AT1-AA組促炎癥因TNF-α的表達(dá)下調(diào),而抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)上調(diào),經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、通過(guò)Realtime-PCR對(duì)各組大鼠胎盤和三角區(qū)組織中的因子TNF-α,IL-10和具有細(xì)胞保護(hù)作用的因子HO-1的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)大鼠給予AT1-AA注射后TNF-α被上調(diào),HO-1被

11、下調(diào),AT1-AA組與NP組比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予HU-MSCs治療后,TNF-α被下調(diào),HO-1被上調(diào),AT1-AA+MSCs組與AT1-AA組比較,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。胎盤和三角區(qū)中IL-10mRNA在各組之間未見(jiàn)顯著性差異。
　　 7、LV-GFP標(biāo)記后HU-MSCs注射到AT1-AA+MSCs組大鼠體內(nèi)后,在熒光顯微鏡下直接尋找GFP的綠色熒光結(jié)果表明,在大鼠的胎盤和三角區(qū)

12、及腎臟組織中僅能找到少許HU-MSCs,在胎鼠的心臟、腎臟、肝臟和肺臟中均未見(jiàn)HU-MSCs。
　　 結(jié)論:
　　 1、人類臍帶組織可以分離出HU-MSCs,LV-GFP體外標(biāo)記細(xì)胞效率高,可以作為良好的細(xì)胞移植的細(xì)胞示蹤材料。HU-MSCs的細(xì)胞漿中存在較強(qiáng)的HO-1表達(dá)。
　　 2、大鼠源性AT1R多肽能夠誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生AT1-AA,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了大鼠源性AT1-AA的存在,并成功的對(duì)抗體進(jìn)行分離、純化,證實(shí)了A