無基礎疾病的肺隱球菌病患者細胞免疫功能變化及其機理探討.pdf

1、研究背景及目的：
　　肺隱球菌?。≒ulmonary Cryptococcosis PC）是由新型隱球菌感染引起的一種肺真菌病。新型隱球菌是一種條件致病菌，其孢子可隨塵埃被吸入呼吸道內(nèi)而引起呼吸道感染。PC是常見的機會性感染，特別是在免疫功能低下者，如AIDS、器官移植等患者。近年來，PC的病例報告有增加的趨勢，也常見于無基礎疾病及免疫缺陷的中年人。這類患者癥狀多不明顯，常在體檢中被發(fā)現(xiàn)，更易被漏診、誤診，宿主免疫功能降低時易播散

2、，甚至可引起嚴重的隱球菌性腦膜炎，治療難度大，是世界范圍內(nèi)影響人類健康的疾病。
　　新型隱球菌的清除主要取決于宿主的免疫功能狀態(tài)以及對感染所起的防御反應。宿主抵抗隱球菌感染主要通過IL-12/IFN-γ途徑激活的Th1的保護性細胞免疫和巨噬細胞的吞噬清除。無基礎疾病的人群，吸入新型隱球菌孢子后，宿主啟動機體的免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機體對新型隱球菌的易感性和抵抗力以有效清除新型隱球菌。而對于AIDS患者，由于HIV感染導致宿主CD4+T淋巴

3、細胞減少或缺乏，機體免疫功能抑制或低下，細胞免疫從Th1向Th2失衡，妨礙了隱球菌的清除，表現(xiàn)為患病。另一方面，新型隱球菌也能影響T淋巴細胞的活化、分化及存活，干擾Th1的分化和促進Th2的非保護性作用，從而影響機體的免疫功能。新型隱球菌感染宿主后，與宿主相互作用，改變其免疫狀態(tài)，逃避宿主細胞免疫的清除作用，這可能解釋新型隱球菌感染長期潛伏以及無基礎疾病患者患病的原因。因此，研究無基礎疾病的PC患者的細胞免疫功能變化，探討其機理對PC的

4、防治具有非常重要的意義。
　　本實驗應用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）的方法來測定分析PC患者和健康對照組血清IL-12、IFN-γ和IL-4分泌水平的差異，為闡明無基礎疾病的PC患者的細胞免疫功能變化提供線索。同時，通過觀察IL-12對PC患者及健康對照組外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）IFN-γ

5、和IL-4釋放的影響，了解無基礎疾病的PC患者IL-12/ IFN-γ等細胞因子的相互影響，初步探討無基礎疾病PC患者中新型隱球菌長期潛伏以及逃逸宿主細胞免疫的分子機制。
　　方法：
　　1、樣本收集處理：收集無基礎疾病PC的患者20例，健康對照組20例。抽取無菌肝素抗凝靜脈血10ml，低速（2500rpm）離心分離血清，分裝，低溫（-80℃）保存。應用ELISA法檢測IL-12、IFN-γ和IL-4。
　　2、PBM

6、C分離培養(yǎng)及上清液細胞因子測定：低速離心（2500rpm）后，應用微量移液器將上層血清分裝于1.5ml干凈無菌EP管中，-80℃冰箱備用；下層細胞中加入適量淋巴細胞分離液，常規(guī)分離 PBMC，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1x10^6/ml,植入24孔培養(yǎng)板，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱箱孵育，按加入刺激物的不同分為兩組：
　　RPMI1640空白對照組，rhIL-12(20 ng/ ml)組,終體積均為1

7、ml,復孔對照。培養(yǎng)48h后，離心棄沉淀后收集上清液，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用ELISA法測定IFN-γ、IL-4。
　　結(jié)果：
　　1、PC組血清IL-12、IFN-γ和IL-4濃度的變化：
　　PC組和健康對照組血清 IL-12、IFN-γ和IL-4濃度分別為（2.514±0.54pg/ml）vs（2.517±0.58pg/ml），（14.52±2.71pg/ml）vs（81.80±9.84pg/ml），（6

8、.90±1.25pg/ml）vs（7.31±1.47pg/ml）。經(jīng)檢驗，PC患者血清IFN-γ水平明顯低于正常對照組(P<0.01)，而兩組之間IL-12和IL-4的平均濃度無顯著性差異（P>0.05）。
　　2、PC組PBMC上清液IFN-γ和IL-4濃度的變化：
　　PC組和健康對照組上清液在加入rhIL-12前IFN-γ和IL-4濃度分別為（55.69±13.61pg/ml） vs（51.13±17.54pg/ml）

9、，（5.056±0.6785pg/ml）vs（5.025±0.6403pg/ml），兩組之間IFN-γ和IL-4的平均濃度無顯著性差異（P>0.05）。
　　3、PC組細胞免疫功能的變化
　　PC組和健康對照組上清液IFN-γ、IL-4的平均濃度加入rhIL-12刺激后增加的倍數(shù)分別為：（4.3±0.5倍）vs（7.9±1.1倍），（0.86±0.43倍）vs（1.27±0.35倍）。經(jīng)檢驗，PC組上清液IFN-γ平均濃度增