糖尿病Pdx1抗原免疫治療及骨髓干細(xì)胞促I(mǎi)NS-1細(xì)胞修復(fù)作用的相關(guān)研究.pdf

1、第一部分Pdx1抗原免疫治療延緩了NOD小鼠糖尿病的發(fā)病
　　 1型糖尿病特點(diǎn)為自身反應(yīng)性T細(xì)胞識(shí)別一系列胰島特異性抗原,導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的選擇性破壞。多種自身抗原可用于指導(dǎo)免疫治療,包括胰島素抗原、谷氨酸脫羧酶抗原、胰島細(xì)胞抗原等。自身反應(yīng)性T細(xì)胞針對(duì)這些抗原的反應(yīng)存一定的等級(jí),自身反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)胰島素抗原的識(shí)別反應(yīng)被認(rèn)為是位于對(duì)其他抗原反應(yīng)的上游。胰島素特異性的免疫治療在1型糖尿病嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型身上顯示出一些保護(hù)作用,然而,胰

2、島素抗原特異性的免疫治療在糖尿病臨床治療方面療效不佳。這暗示著抗原特異性的免疫治療原理十分復(fù)雜,或許,糖尿病患者體內(nèi)存在其他一些未知的自身抗原,利用這些未知的自身抗原免疫可能會(huì)產(chǎn)生更好的治療效果。
　　 胰腺十二指腸同源盒1是胰腺發(fā)育中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,在β細(xì)胞的分化和功能維持方面也起著十分重要的作用。在成熟的β細(xì)胞,Pdx1參與胰島素基因表達(dá)的調(diào)控。在我們以前發(fā)表的文章中,我們報(bào)道了基因重組Pdx1蛋白可改善脲鏈佐菌素所致的糖尿

3、病小鼠的血糖水平,通過(guò)促進(jìn)胰腺的再生和促進(jìn)肝細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞而起作用。進(jìn)而,我們發(fā)現(xiàn)Pdx1是非肥胖糖尿病小鼠小鼠體內(nèi)新的胰島β細(xì)胞特異性的自身抗原,在NOD小鼠糖尿病的初期和糖尿病期,以及一部分糖尿病患者體內(nèi)都可檢測(cè)到針對(duì)Pdxl的自身抗體?！甆OD小鼠是模擬l型糖尿病較好的動(dòng)物模型,雌性的NOD小鼠一般在12-14周齡左右自發(fā)進(jìn)展為糖尿病,其特點(diǎn)為T(mén)細(xì)胞介導(dǎo)的胰島免疫浸潤(rùn)和胰島β細(xì)胞免疫破壞。在這個(gè)試驗(yàn)中,我們嘗試不同的抗原

4、輸注方法,觀察Pdx1蛋白免疫治療是否可延緩NOD小鼠糖尿病的發(fā)病,并進(jìn)行了脾細(xì)胞過(guò)繼移植實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、胰腺免疫組化、細(xì)胞流式分析、實(shí)時(shí)定量PCR及體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等相關(guān)研究,以分析其免疫治療機(jī)制。
　　 目的：
　　 研究Pdx1免疫治療是否會(huì)延緩雌性‘NOD小鼠糖尿病的發(fā)病及可能的免疫治療機(jī)制。
　　 方法
　　 在這個(gè)試驗(yàn)中,七或十周齡的NOD小鼠接受Pdx1的免疫治療。因?yàn)橹委熜Ч?/p>

5、以受很多因素的影響,我們?cè)囼?yàn)中嘗試了不同的抗原輸注方法,以及不同的抗原輸注劑量和時(shí)間。不同的抗原輸注方法包括腹腔注射、皮下注射或口服:不同的輸注劑量和時(shí)間是指用于實(shí)驗(yàn)的NOD小鼠分別選自7周或10周,接受Pdx1的免疫治療維持的周數(shù)也有所不同。每周檢測(cè)NOD小鼠血糖狀況,血糖水平大于11.1 mmol/l并持續(xù)兩天被認(rèn)為是糖尿病發(fā)病。
　　 為明確其可能的機(jī)制,進(jìn)行了以下分析:
　　 (1)過(guò)繼移植實(shí)驗(yàn):將接受Pdx1免

6、疫的NOD小鼠的脾細(xì)胞分離出,移植入非肥胖糖尿病、重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內(nèi),觀察NOD-SCID小鼠糖尿病的發(fā)病情況；
　　 (2)體內(nèi)T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將CD4+T細(xì)胞從NOD.BDC2.5小鼠的脾臟中分離出,體外經(jīng)熒光染料羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯標(biāo)記后,經(jīng)尾靜脈注射入Pdx1蛋白處理過(guò)的NOD小鼠體內(nèi)；5天以后,將NOD小鼠的胰腺淋巴結(jié)細(xì)胞和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞分離出,細(xì)胞流式評(píng)估CFSE標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞在NOD小鼠體內(nèi)

7、增殖的情況；
　　 (3)胰腺免疫組化研究:M-Pdx1蛋白處理的NOD小鼠接受胰腺免疫組化研究。胰島組織切片行HE染色和胰島素染色,并對(duì)胰島炎進(jìn)行評(píng)分；
　　 (4)細(xì)胞流式:細(xì)胞流式分析M-Pdx1蛋白免疫NOD小鼠是否可改變脾臟、胰腺淋巴結(jié)中CD4+/CD8+T細(xì)胞的比例,分析CD4+FoxP3+Treg、IL-10分泌細(xì)胞和Th-17細(xì)胞等的變化情況,細(xì)胞流式分析IL-4、IL-10、IFN-γ等細(xì)胞因子表達(dá)情況

8、；
　　 (5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析M-Pdx1蛋白免疫NOD小鼠對(duì)各種細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響,包括IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ、TGF-α、TGF-β及FoxP3等；
　　 (6)T細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn):觀察Pdx1蛋白免疫的NOD小鼠,脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)不同抗原刺激的體外增殖情況；
　　 結(jié)果：
　　 與對(duì)照組相比,將Pdx1蛋白腹腔或皮下輸注免疫NOD小鼠可較好地延緩NOD小鼠糖

9、尿病的發(fā)病,但口服Pdx1蛋白沒(méi)有顯示出明顯的免疫預(yù)防效果。
　　 對(duì)照組PBS處理的NOD小鼠的脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給NOD-SCID小鼠時(shí),轉(zhuǎn)移后大多3周內(nèi)發(fā)生糖尿病。將Pdx1(或M-Pdx1蛋白)處理的NOD小鼠的脾細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移給NOD-SCID小鼠時(shí),NOD-SCID小鼠發(fā)生糖尿病的時(shí)間明顯推遲。這提示Pdx1(或M-Pdx1蛋白)免疫NOD小鼠可能激活免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,且這種保護(hù)作用是可轉(zhuǎn)移的。
　　 CFSE標(biāo)記的C

10、D4+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):在腹股溝淋巴結(jié),M-Pdx1蛋白(或?qū)φ盏鞍?處理的NOD小鼠,CFSE標(biāo)記的NOD.BDC2.5 CD4+T細(xì)胞都無(wú)明顯增殖,無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；而在胰腺淋巴結(jié),對(duì)照組NOD小鼠胰腺淋巴結(jié)內(nèi)CFSE標(biāo)記的NOD.BDC2.5 CD4+T細(xì)胞增殖明顯,與M-Pdx1蛋白處理的NOD小鼠形成明顯的反差,M-Pdx1蛋白處理的NOD小鼠NOD.BDC2.5 CD4+T細(xì)胞增殖受到抑制(p<0.05)

11、。此結(jié)果表明M-Pdx1蛋白處理可能誘導(dǎo)NOD小鼠體內(nèi)Treg的產(chǎn)生,從而對(duì)移植入體內(nèi)的CFSE標(biāo)記的NOD.BDC2.5 CD4+T細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制調(diào)節(jié)作用。
　　 胰腺免疫組化結(jié)果顯示:對(duì)照組NOD小鼠胰島淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較嚴(yán)重,胰島素染色陽(yáng)性的β細(xì)胞數(shù)量降低,胰高血糖素細(xì)胞代償性增多。與此對(duì)比,經(jīng)M-Pdx1處理的NOD小鼠淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)減少,胰島素染色陽(yáng)性的β細(xì)胞占胰島細(xì)胞的絕大部分,胰島炎評(píng)分優(yōu)于對(duì)照組。
　　 細(xì)

12、胞流式結(jié)果表明:M-Pdx1免疫NOD小鼠可上調(diào)脾細(xì)胞內(nèi)CD4+Foxp3+Treg的比例和IL-10分泌細(xì)胞的比例。M-Pdx1免疫NOD小鼠可下調(diào)Th-17細(xì)胞的比例；而CD4+/CD8+的比值、IFN-γ分泌細(xì)胞的比例等無(wú)明顯變化。
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示:利用M-Pdx1蛋白免疫處理NOD小鼠可上調(diào)Th2相關(guān)基因的表達(dá),如IL-4,IL-10,Foxp3,TGF-α及TGF-β；下調(diào)Th1相關(guān)基因的表達(dá)

13、,如IL-2,IFN-γ等。同時(shí),利用M-Pdx1蛋白免疫NOD小鼠可提高FoxP3基因的表達(dá)。
　　 體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):對(duì)照組NOD小鼠分離出的T細(xì)胞對(duì)Pdx1蛋白抗原刺激表現(xiàn)出明顯的增殖,與Pdx1蛋白免疫處理的NOD小鼠相比,p<0.05；這提示利用Pdx1蛋白免疫NOD小鼠可導(dǎo)致體內(nèi)Pdx1抗原特異性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞功能降低。通過(guò)Pdx1蛋白免疫NOD小鼠,T細(xì)胞對(duì)胰島素的增殖反應(yīng)也降低。利用Pdx1蛋白免疫的NOD

14、小鼠T細(xì)胞分泌IFN-γ的水平降低。
　　 結(jié)論：利用Pdx1蛋白(或M-Pdx1蛋白)免疫NOD小鼠可較好地預(yù)防NOD小鼠糖尿病的發(fā)病,其機(jī)制可能為誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性或克隆清除,誘導(dǎo)CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生,上調(diào)IL-10分泌細(xì)胞比例,下調(diào)Th-17細(xì)胞的數(shù)量,以及影響Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞的比例。利用Pdx1抗原免疫治療1型糖尿病是一個(gè)很有希望的治療方法。
　　 第二部分
　　 利用共

15、培養(yǎng)微流控細(xì)胞芯片觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否可改善
　　 IL-1β/IFN-γ所導(dǎo)致的INS-1細(xì)胞凋亡及功能不全
　　 目的：
　　 利用微流控細(xì)胞芯片技術(shù)制作共培養(yǎng)細(xì)胞芯片,將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs)和INS-1細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),我們觀察BM-MSCs所分泌的一些細(xì)胞因子是否可改善IL-1β/IFN-T所導(dǎo)致的INS-

16、1細(xì)胞凋亡及功能不全。
　　 方法
　　 設(shè)計(jì)制備共培養(yǎng)微流控細(xì)胞芯片。BM-MSCs從糖尿病患者中獲取,細(xì)胞流式分析細(xì)胞表面分子的表達(dá)。將BM-MSCs和INS-1細(xì)胞分別接種于微流控芯片不同的培養(yǎng)小室,保持培養(yǎng)液從BM-MSCs向INS-1細(xì)胞的單向流動(dòng)。INS-1細(xì)胞培養(yǎng)基中添加細(xì)胞因子IL-1β及IFN-γ,同時(shí)INS.1細(xì)胞也接受BM.MSCs培養(yǎng)液的影響。Annexin V/PI雙染分析BM-MSCs對(duì)IL-

17、1β/IFN-γ所致的細(xì)胞凋亡的抑制作用；應(yīng)用RIA分析BM-MSCs是否可改善IL-1β/IFN-γ所致的INS-1細(xì)胞胰島素分泌功能不全。免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析IL-1β/IFN-γ及BM-MSCs對(duì)INS-1細(xì)胞胰島素含量及胰島素基因表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 微流控細(xì)胞芯片可以確保培養(yǎng)液從BM-MSCs向INS-1細(xì)胞的單向持續(xù)的流動(dòng),是體外觀察兩種細(xì)胞間單向作用的好工具。在此試驗(yàn)中,在不同的時(shí)間

18、可觀察到IL-1β/IFN-γ可導(dǎo)致INS-1細(xì)胞凋亡和胰島素分泌功能受損,BM-MSCs所分泌的一些細(xì)胞因子可改善IL-1β/IFN-γ所導(dǎo)致的INS-1細(xì)胞凋亡和胰島素分泌功能受損,增加細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量,促進(jìn)胰島素基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 共培養(yǎng)微流控細(xì)胞芯片是體外觀察干細(xì)胞與其他細(xì)胞作用的好工具。BM-MSCs可能通過(guò)分泌一些抗炎性、抗凋亡和營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)INS-1細(xì)胞的存活,促進(jìn)INS-1細(xì)胞胰島素分泌及